Modification of targets related to the Entner-Doudoroff/pentose phosphate pathway route for methyl-D-erythritol 4-phosphate-dependent carotenoid biosynthesis in Escherichia coli
- 作者
- Chun Li, Lan-Qing Ying, Sha-Sha Zhang, Nan Chen, Wei-Feng Liu, Yong Tao
- 单位
- 中国科学院微生物研究所微生物生理与代谢工程重点实验室，北京；中国科学院大学生命科学学院，北京
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2015）
- DOI
- 10.1186/s12934-015-0301-x
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在大肠杆菌中，依赖MEP途径的类胡萝卜素生物合成需要前体甘油醛-3-磷酸（G3P）和丙酮酸的充足且平衡供应，但内源代谢网络中前体供给失衡，特别是G3P与丙酮酸的化学计量不平衡，成为限速瓶颈。
研究策略
系统改造大肠杆菌中心碳代谢途径中的多个基因靶点，将代谢流从EMP途径导向Entner-Doudoroff（ED）和磷酸戊糖（PP）途径，同时增强MEP途径，并结合蛋白支架共定位、启动子工程和葡萄糖摄取优化，以重新平衡前体供给、辅因子（NADPH）和副产物代谢。
核心内容
该研究以大肠杆菌BW25113为底盘，系统改造中心碳代谢中EMP、ED和PP途径的多个基因靶点，以解决MEP途径类胡萝卜素合成中前体甘油醛-3-磷酸与丙酮酸供给失衡的瓶颈。通过比较不同基因敲除和过表达组合，发现敲除pgi比敲除pfkAB更有利于类胡萝卜素合成，而过表达zwf、eda可提升产量，敲除edd或gnd则显著降低产量。在MEP途径增强背景下，将代谢流导向ED/PP途径可显著提升神经孢子烯产量，其中最优菌株PTXI-SXID036在微反应器发酵中产量达16.69 mg/g DCW，效价202.64 mg/L，同时乙酸积累从野生型的7.86 mg/mL降至0.21 mg/mL。利用纤维素体cohesin-dockerin蛋白支架将Eda和Dxs共定位可进一步提高产量约30%。最终工程菌株PTXIGK-AEGG-SXID10RK的番茄红素产量达17.8±0.2 mg/g DCW，是非ED/PP途径菌株的3.6倍。该研究揭示了增强ED途径高效提供前体、PP途径发挥回补作用为核心策略，同时需精细平衡前体供给、NADPH生成和副产物代谢，为MEP途径依赖的萜类化合物高产提供了可行的代谢工程范例。
创新点
1. 系统比较了EMP、ED、PP途径中多个基因敲除/过表达对类胡萝卜素合成的影响；2. 利用Clostridium的纤维素体cohesin-dockerin蛋白支架将Eda和Dxs共定位，使神经孢子烯产量提高约30%；3. 精细调控gnd表达水平以平衡ED和PP途径通量；4. 发现敲除pgi比敲除pfkAB更有利于类胡萝卜素合成，揭示PP途径的anaplerotic（回补）作用；5. 最终工程菌株通过ED/PP途径路线实现番茄红素高产。
研究对象（17）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BW25113 | EMP途径/ED/PP分支点 | pgi | 葡萄糖-6-磷酸异构酶 | 催化 | 敲除pgi使代谢流导向ED/PP途径，提高类胡萝卜素产量约25% |
| Escherichia coli BW25113 | EMP途径 | pfkA | 6-磷酸果糖激酶I | 催化 | 敲除pfkA提高神经孢子烯产量约25% |
| Escherichia coli BW25113 | EMP途径 | pfkB | 6-磷酸果糖激酶II | 催化 | 敲除pfkB提高神经孢子烯产量约25% |
| Escherichia coli BW25113 | EMP途径 | fbaB | 果糖二磷酸醛缩酶II | 催化 | 敲除fbaB对神经孢子烯产量无显著影响 |
| Escherichia coli BW25113 | 磷酸戊糖途径 | zwf | 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 | 催化 | 过表达zwf使神经孢子烯产量提高约20% |
| Escherichia coli BW25113 | Entner-Doudoroff途径 | edd | 6-磷酸葡萄糖酸脱水酶 | 催化 | 过表达edd使产量降低约20%，敲除edd完全失去ED途径 |
| Escherichia coli BW25113 | Entner-Doudoroff途径 | eda | 2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶 | 催化 | 过表达eda提高产量约12%，与Dxs共表达或蛋白支架共定位进一步提高 |
| Escherichia coli BW25113 | 磷酸戊糖途径 | gnd | 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶 | 催化 | 适度表达gnd与eda组合最有利于神经孢子烯合成，敲除gnd与eda共表达效果差 |
| Escherichia coli BW25113 | MEP途径 | dxs | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 | 催化 | MEP途径第一个酶，强化dxs是提高产量的关键策略之一 |
| Escherichia coli BW25113 | MEP途径 | idi | 异戊烯基二磷酸异构酶 | 催化 | 强化idi增强IPP/DMAPP供给 |
| Escherichia coli BW25113 | MEP途径 | ispDF | MEP途径酶（IspD/IspF） | 催化 | 与dxs、idi共同过表达增强MEP通量 |
| Escherichia coli BW25113 | 葡萄糖转运系统 | ptsG | 葡萄糖PTS透性酶 | 转运 | 敲除ptsG减少丙酮酸和ATP消耗，改善前体供给 |
| Escherichia coli BW25113 | 葡萄糖磷酸化 | glk | 葡萄糖激酶 | 催化 | 插入P119-glk释放galR抑制，增强非PTS葡萄糖摄取 |
| Escherichia coli BW25113 | 类胡萝卜素合成 | crtE | 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶 | 催化 | 来自Pantoea agglomerans，参与类胡萝卜素前体合成 |
| Escherichia coli BW25113 | 类胡萝卜素合成 | crtB | 八氢番茄红素合酶 | 催化 | 来自Pantoea ananatis，参与番茄红素合成 |
| Escherichia coli BW25113 | 类胡萝卜素合成 | crtI | 八氢番茄红素脱饱和酶 | 催化 | 来自Rhodobacter sphaeroides或Pantoea ananatis，催化脱饱和反应 |
| Escherichia coli BW25113 | 蛋白支架区室化 | scaffold | 纤维素体支架蛋白（cohesin-dockerin） | 区室化 | 来自Clostridium，用于将Eda和Dxs共定位，提高底物通道效率 |
关键发现
- 野生型BW25113中神经孢子烯产量为2.05 mg/g DCW，番茄红素为1.64 mg/g DCW。敲除pgi使神经孢子烯产量提高约25%
- 敲除pfkA、pfkB、pfkAB也约提高25%
- 过表达Zwf提高约20%，过表达Eda提高约12%，过表达edd降低约20%。在MEP增强背景下，单独用T5启动子增强dxs（TX036）产量为3.20 mg/g DCW，质粒表达dxs（SX036）为5.03 mg/g DCW，组合为5.30 mg/g DCW
- 在Δpgi背景中上述三种策略产量分别达6.94、9.40、10.71 mg/g DCW，是野生型的1.51-1.88倍。Eda增强再提高25%，蛋白支架再提高约30%。敲除edd或gnd均使产量显著下降。在MEP增强且Δpgi背景中，敲除pfkA或pfkAB的产量低于Δpgi。微反应器发酵中，最优菌株PTXI-SXID036神经孢子烯产量达16.69 mg/g DCW，生物量OD600为40.47，效价202.64 mg/L
- 乙酸积累从野生型的7.86 mg/mL降至0.21 mg/mL。最终工程菌PTXIGK-AEGG-SXID10RK番茄红素产量为17.8±0.2 mg/g DCW，是非ED/PP途径菌株TXI-SXID10RK的3.6倍。
研究结论
通过协调改造ED和PP途径的多个基因靶点，实现了高效平衡的MEP依赖性类胡萝卜素生物转化。增强ED途径以高效提供G3P和丙酮酸是关键，PP途径的回补作用为ED途径补充前体，并需精细平衡前体供给、NADPH生成和副产物代谢。最终在提高类胡萝卜素产量的同时增加了生物量并减少了乙酸积累。