Genome shuffling of the nonconventional yeast Pichia anomala for improved sugar alcohol production
- 作者
- Guoqiang Zhang, Yuping Lin, Xianni Qi, Lixian Wang, Peng He, Qinhong Wang, Yanhe Ma
- 单位
- Key Laboratory of Systems Microbial Biotechnology, Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, 32 XiQiDao, Tianjin Airport Economic Area, Tianjin 300308, China; University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; Key Laboratory of Microbial Physiological and Metabolic Engineering, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2015）
- DOI
- 10.1186/s12934-015-0303-8
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
提高非常规酵母Pichia anomala的糖醇产量，克服传统诱变育种效率低和缺乏选择性遗传标记导致杂交体筛选困难的问题。
研究策略
采用基因组改组（genome shuffling）策略，结合UV和ARTP诱变构建突变库，通过原生质体融合和荧光激活细胞分选（FACS）筛选杂合细胞，再利用优化的比色法高通量筛选糖醇高产菌株，经过两轮改组获得优良菌株。
核心内容
针对非常规酵母Pichia anomala糖醇产量提升中传统诱变效率低、杂交体缺乏选择性标记难筛选的问题，本研究采用基因组改组策略系统改良菌株。首先以UV和ARTP诱变构建突变库，获得较原始菌株提高7.3%–12.9%的突变株；随后开发基于荧光激活细胞分选的无遗传标记原生质体融合筛选法，从约250万个原生质体中选出15300个潜在杂合细胞并再生；同时优化了一种不受葡萄糖和乙醇干扰的比色法进行高通量糖醇检测，其线性范围0–12 g/L，与HPLC结果回归R²=0.9673。经两轮改组，获得菌株GS2-3，以100 g/L葡萄糖为底物时总糖醇产量达47.1 g/L，较原始菌株提高32.3%，其中D-阿拉伯醇产率0.32 g/g（提高23.1%），核糖醇产量10.98 g/L（原始为7.51 g/L）。结果表明，结合比色法与FACS的基因组改组策略有效突破非模式酵母的育种瓶颈，为其他非常规微生物的性状改良提供了通用平台。
创新点
优化了比色法用于糖醇高通量筛选，具有简单、准确、低成本且不受葡萄糖和乙醇干扰的优点；开发了基于FACS的无遗传标记的原生质体融合筛选方法，适用于非模式酵母；首次将基因组改组应用于糖醇生产菌株改良。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia anomala TIB-x229 | 糖醇合成途径 | — | — | 催化 | 原始菌株，可产生D-阿拉伯醇、核糖醇和木糖醇 |
| Pichia anomala HP | 糖醇合成途径 | — | — | 催化 | 由TIB-x229分离的单倍体亲本菌株 |
| Pichia anomala突变株U-7、U-9、A-4、A-1 | 糖醇合成途径 | — | — | 催化 | 经UV或ARTP诱变获得的突变体，糖醇产量分别提高7.3%、8.9%、12.3%、12.9% |
| Pichia anomala第一轮改组菌株GS1-1、GS1-2、GS1-3 | 糖醇合成途径 | — | — | 催化 | 第一轮基因组改组获得，糖醇产量提高19.5%、25.6%、23.9% |
| Pichia anomala第二轮改组菌株GS2-1、GS2-2、GS2-3 | 糖醇合成途径 | — | — | 催化 | 第二轮基因组改组获得，总糖醇产量分别为46.1、46.5、47.1 g/L，提高29.5%、30.6%、32.3% |
关键发现
- 通过两轮基因组改组，获得菌株GS2-3，总糖醇产量为47.1 g/L（100 g/L葡萄糖为底物），比原始菌株TIB-x229提高32.3%
- D-阿拉伯醇产量达0.32 g/g，提高23.1%
- 核糖醇产量为10.98 g/L（原始菌株为7.51 g/L）。UV突变株U-7和U-9分别提高7.3%和8.9%，ARTP突变株A-4和A-1分别提高12.3%和12.9%
- 第一轮改组菌株GS1-1、GS1-2、GS1-3提高19.5%、25.6%和23.9%
- 第二轮改组菌株GS2-1、GS2-2、GS2-3总糖醇产量分别为46.1、46.5和47.1 g/L，提高29.5%、30.6%和32.3%。比色法检测D-阿拉伯醇线性范围0-12 g/L，与HPLC回归R²=0.9673。FACS分选约250万个原生质体，选出15300个潜在杂合细胞，再生后约1000个菌落。
研究结论
本研究开发了一种可行性基因组改组策略，结合比色法和FACS，成功提高了非常规糖醇生产酵母P. anomala的糖醇产量。两轮改组后获得的高产菌株GS2-3具有显著优势，该策略为其他天然或非常规微生物的菌株改良提供了普适性平台。