高级醇 · 代谢工程文献库

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Cloning and characterization of enoate reductase with high β-ionone to dihydro-β-ionone bioconversion productivity

作者
Xuesong Zhang, Shiyong Liao, Fuliang Cao, Linguo Zhao, Jianjun Pei, Feng Tang
单位
Co-Innovation Center for Sustainable Forestry in Southern China, Nanjing Forestry University; College of Chemical Engineering, Nanjing Forestry University; College of Tea and Food Science and Technology, Jiangsu Polytechnic College of Agriculture and Forestry; Jiangsu Key Lab for the Chemistry & Utilization of Agricultural and Forest Biomass; International centre for bamboo and rattan
杂志
BMC Biotechnology（2018）
DOI
10.1186/s12896-018-0438-x
所属领域
代谢工程
关键词
Artemisinic aldehyde reductaseDihydro-β-iononeEnoate reductasesβ-ionone
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解决的核心问题

传统化学法制备二氢-β-紫罗兰酮存在催化剂昂贵、需要高压、重金属配体处理困难等问题，急需开发绿色高效的生物转化方法。

研究策略

从四种重组菌株中筛选高转化效率的烯酸还原酶（DBR1），通过全细胞转化β-紫罗兰酮生产二氢-β-紫罗兰酮，并对DBR1进行异源表达、纯化和酶学表征。

研究路线图

100%
研究问题：化学法合成二氢-β-紫罗兰酮存在催化剂昂贵、高压、重金属污染等问题
策略：筛选并异源表达高选择性烯酸还原酶（DBR1）
关键改造：从4种重组菌株中筛选DBR1，构建大肠杆菌全细胞转化体系
结果：全细胞转化产量308.3 mg/L，纯酶比活力356.39 U/mg
结论：DBR1高效催化β-紫罗兰酮生成二氢-β-紫罗兰酮，提供绿色新途径
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核心内容

针对传统化学法合成二氢-β-紫罗兰酮中催化剂昂贵、需高压及重金属污染等问题，该研究旨在开发绿色高效的生物转化途径。研究从四种候选重组菌株中筛选出催化效率最高的烯酸还原酶DBR1，于大肠杆菌中进行异源表达、纯化及酶学表征，并利用全细胞催化β-紫罗兰酮加氢。结果表明，重组菌pET-28a-DBR1全细胞转化β-紫罗兰酮时，二氢-β-紫罗兰酮最高产量达308.3 mg/L，比活性最高的对照菌株高256倍。纯化后的DBR1最适反应条件为45°C和pH 6.5，比活力达356.39 U/mg；在酶促体系中，1 mM底物可生成91.08 mg/L产物，摩尔转化率高达93.80%，且酶对底物的Km和Vmax分别为0.55 mM和14.77 U/mg。该研究首次证实DBR1能高选择性地还原β-紫罗兰酮10,11位双键，兼具高催化效率和产物转化率，为工业化绿色合成二氢-β-紫罗兰酮提供了极具潜力的新酶源。

创新点

首次报道利用烯酸还原酶（enoate reductase）将β-紫罗兰酮生物转化为二氢-β-紫罗兰酮；发现DBR1对β-紫罗兰酮10,11位不饱和双键具有高选择性和高催化效率。

研究对象（4）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Escherichia coli BL21(DE3) β-紫罗兰酮生物还原途径 DBR1 enal reductase DBR1（青蒿醛还原酶） 催化 来自Artemisia annua，NCBI FJ750460.1，催化β-紫罗兰酮C10-C11双键加氢，整细胞产量308.3 mg/L，纯酶比活力356.39 U/mg
Escherichia coli BL21(DE3) β-紫罗兰酮生物还原途径 DBR2 青蒿醛Δ11(13)还原酶 DBR2 催化 来自Artemisia annua，NCBI BAU61367.1，对β-紫罗兰酮转化活性很低
Escherichia coli BL21(DE3) β-紫罗兰酮生物还原途径 BacOYE1 老黄酶 BacOYE1 催化 来自Bacillus sp.，NCBI KJ577134.1，对β-紫罗兰酮转化活性很低
Escherichia coli BL21(DE3) β-紫罗兰酮生物还原途径 CL2687.Contig2_ALL 推测烯酸还原酶 2687 催化 来自Osmanthus fragrans转录组（SRA SRP057917），与DBR2有78%同源性，转化活性低

关键发现

  1. 重组菌株pET-28a-DBR1全细胞转化β-紫罗兰酮，二氢-β-紫罗兰酮最高产量达308.3 mg/L
  2. 纯化后DBR1最适温度45°C、最适pH 6.5，纯酶比活力356.39 U/mg
  3. 在酶促转化体系中，1 mM β-紫罗兰酮可转化为91.08 mg/L二氢-β-紫罗兰酮，摩尔转化率93.80%
  4. DBR1对β-紫罗兰酮的Km和Vmax分别为0.55 mM和14.77 U/mg
  5. 与对照菌株相比，pET-28a-DBR1产量比PGEX-4T1-2687高256倍、比PGEX-4T1-DBR2高270倍、比pET-28a-BacOYE1高770倍。

研究结论

DBR1是具有高选择性和高催化效率的烯酸还原酶，能高效催化β-紫罗兰酮生成二氢-β-紫罗兰酮，为工业化绿色生产二氢-β-紫罗兰酮提供了新途径。