MEP pathway-mediated isopentenol production in metabolically engineered Escherichia coli
- 作者
- Huawei Liu, Yang Wang, Qiang Tang, Wentao Kong, Wook-Jin Chung, Ting Lu
- 单位
- Department of Bioengineering, University of Illinois at Urbana-Champaign, Urbana IL61801, USA; Institute for Genomic Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign, Urbana IL61801, USA; Energy and Environment Fusion Technology Center (E2FTC), Department of Energy and Biotechnology (DEB), Myongji University, Yongin-si, Gyeonggi-do 449-728, Republic of Korea; Department of Physics, University of Illinois at Urbana-Champaign, Urbana IL61801, USA
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2014）
- DOI
- 10.1186/s12934-014-0135-y
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
当前大肠杆菌异戊烯醇产量低，其生物合成途径需要系统优化。本研究旨在通过优化大肠杆菌内源MEP途径及其上游糖酵解途径，提高异戊烯醇（prenol和isoprenol）的产量。
研究策略
多步代谢工程优化：首先在E. coli W3110中表达来自枯草芽孢杆菌的密码子优化基因nudF和yhfR，赋予异戊烯醇生产能力；然后过表达MEP途径关键酶ispG和dxs，增强MEP通量；最后通过敲除pgi基因将糖酵解从EMP途径转向PPP和ED途径，平衡前体供应并增加NADPH。
核心内容
该研究通过多步代谢工程系统优化大肠杆菌内源MEP途径，以提高异戊烯醇（prenol和isoprenol）的产量。研究首先在E. coli W3110中异源表达枯草芽孢杆菌的nudF和yhfR基因赋予菌株异戊烯醇生产能力，随后过表达MEP途径限速酶ispG和dxs增强通量，最终敲除pgi基因将糖酵解从EMP途径转向PPP和ED途径，以平衡G3P与丙酮酸前体供应并增加NADPH。实验结果显示，仅表达nudF时产量为prenol 2.6 mg/L和isoprenol 2.2 mg/L；过表达ispG使产量提升1.6倍，再叠加dxs后提升2.1倍；敲除pgi后产量达到30.0 mg/L，较前一轮提高1.9倍。在5L发酵罐中，48小时内总异戊烯醇产量达61.9 mg/L（prenol 35.2 mg/L，isoprenol 26.7 mg/L）。该工作证实了MEP途径前体总通量与平衡对产物合成的重要性，为利用内源途径高效生产异戊烯醇提供了可行策略。
创新点
利用内源MEP途径而非异源MVA途径；系统多步优化；通过敲除pgi激活PPP和ED途径，改善G3P和丙酮酸前体平衡及NADPH供应。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli W3110 | MEP途径 | nudF | NudF | 催化 | 来自枯草芽孢杆菌，密码子优化后表达，催化IPP和DMAPP转化为异戊烯醇（isoprenol和prenol）。菌株EWIP2产生2.6 mg/L prenol和2.2 mg/L isoprenol。 |
| Escherichia coli W3110 | MEP途径 | yhfR | YhfR | 催化 | 来自枯草芽孢杆菌，密码子优化后表达，但产量极低（<1 mg/L）。菌株EWIP1。 |
| Escherichia coli W3110 | MEP途径 | ispG | IspG (HMBPP synthase) | 催化 | 过表达以减少MECPP外流，提高异戊二烯产量，使异戊烯醇产量增加1.6倍（EWIP3）。 |
| Escherichia coli W3110 | MEP途径 | dxs | Dxs (DXP synthase) | 催化 | 过表达增强MEP途径通量，额外增加2.1倍产量（EWIP4）。 |
| Escherichia coli W3110 Δpgi | 糖酵解/PPP/ED | pgi | Pgi (phosphoglucose isomerase) | 催化 | 敲除pgi基因使碳流从EMP转向PPP和ED，产量提高1.9倍，达到30.0 mg/L（EWIP5）。 |
| Escherichia coli W3110 Δpgi | ED途径 | edd-eda operon | Edd/Eda | 催化 | 用Trc启动子替换edd-eda操纵子的天然启动子，但严重抑制生长和异戊烯醇产量（EWIP6）。 |
关键发现
- 表达nudF菌株EWIP2产生2.6 mg L-1 prenol和2.2 mg L-1 isoprenol；过表达ispG使产量增加1.6倍；进一步过表达dxs使产量再增加2.1倍；敲除pgi后产量达到30.0 mg L-1，较EWIP4提高1.9倍；5L发酵中，经48小时获得总异戊烯醇61.9 mg L-1（prenol
- 2 mg L-1，isoprenol
- 7 mg L-1），葡萄糖20 g L-1在24小时耗尽。此外，yhfR表达菌株EWIP1产生的异戊烯醇<1 mg L-1。
研究结论
通过多步优化MEP及其上游糖酵解途径，成功提高了异戊烯醇产量。结果表明，MEP途径前体的总通量及其平衡对异戊烯醇生产至关重要。未来需进一步阐明PPP和ED对MEP的贡献以优化异戊烯醇生产。