Genetic and nutrient modulation of acetyl-CoA levels in Synechocystis for n-butanol production
- 作者
- Josefine Anfelt, Danuta Kaczmarzyk, Kiyan Shabestary, Björn Renberg, Johan Rockberg, Jens Nielsen, Mathias Uhlen, Elton P. Hudson
- 单位
- School of Biotechnology, KTH, Royal Institute of Technology, Science for Life Laboratory, Stockholm, Sweden; Novo Nordisk Foundation Center for Biosustainability, Technical University of Denmark, Hørsholm, Denmark; Department of Chemical and Biological Engineering, Chalmers Institute of Technology, Gothenburg, Sweden
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2015）
- DOI
- 10.1186/s12934-015-0355-9
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
集胞藻光合自养生长时乙酰-CoA碳通量低，限制了正丁醇等发酵产物的合成，需要遗传和营养手段提高乙酰-CoA水平。
研究策略
在敲除PHB合酶的集胞藻中引入正丁醇合成途径，通过氮饥饿和过表达异源磷酸酮醇酶（Xfpk）来增加乙酰-CoA供给，结合通量平衡分析评估代谢通路优化潜力。
核心内容
该研究以集胞藻PCC 6803为底盘，在敲除PHB合酶基因以消除碳存储竞争的基础上引入正丁醇合成途径，并通过遗传和营养手段提升乙酰-CoA供给以促进产物合成。研究中分别采用氮饥饿处理和过表达异源磷酸酮醇酶（Xfpk）两种策略，并结合通量平衡分析评估代谢通路优化潜力。结果显示，氮饥饿使丁醇比产量提高达3倍，乙酰-CoA水平增加2倍；在氮充足条件下表达Xfpk使乙酰-CoA提高6倍，丁醇滴度从22 mg/L增至37 mg/L。JA04菌株（P_trc启动子）在氮充足条件下14天丁醇滴度为34 mg/L，氮饥饿下为25 mg/L，平均比生产力分别为1.1和2.7 mg/gDCW/day。通量平衡分析预测磷酸酮醇酶途径可使丁醇生产的ATP成本从35.7降至19.6 mmol ATP/mmol丁醇，降低45%。该研究首次在蓝藻中利用磷酸酮醇酶提高乙酰-CoA水平，证明了遗传改造和营养调控相结合能有效增强乙酰-CoA衍生品的合成效率，为蓝藻光合生产化学品提供了可互补的代谢工程策略。
创新点
首次在蓝藻中利用磷酸酮醇酶提高乙酰-CoA水平；证实氮饥饿通过增加乙酰-CoA使正丁醇比产量提高3倍；通量平衡分析证明CBB-磷酸酮醇酶途径具有更高理论丁醇生产率和更低的ATP需求。
研究对象（13）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 正丁醇合成途径 | phaA | β-酮硫解酶 (PhaA) | 催化 | 内源基因，催化乙酰-CoA缩合为乙酰乙酰-CoA |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 正丁醇合成途径 | phaB | 乙酰乙酰-CoA还原酶 (PhaB) | 催化 | 内源基因，催化乙酰乙酰-CoA还原为3-羟基丁酰-CoA |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 正丁醇合成途径 | phaJ | 烯酰-CoA水合酶 (PhaJ) | 催化 | 异源表达，来自Aeromonas caviae |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 正丁醇合成途径 | ter | 反式烯酰-CoA还原酶 (Ter) | 催化 | 异源表达，来自Treponema denticola |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 正丁醇合成途径 | adhE2 | 双功能醛/醇脱氢酶 (AdhE2) | 催化 | 异源表达，来自Clostridium acetobutylicum |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 磷酸酮醇酶途径 | xfpk | 磷酸酮醇酶 (Xfpk) | 催化 | 异源表达，来自Bifidobacterium breve，催化F6P/Xu5P生成乙酰磷酸 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 乙酸代谢 | pta | 磷酸转乙酰酶 (Pta) | 催化 | 内源基因，催化乙酰-CoA与乙酰磷酸互变 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 乙酸代谢 | ackA | 乙酸激酶 (AckA) | 催化 | 内源基因，催化乙酸与乙酰磷酸互变 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 乙酸代谢 | acs | 乙酰-CoA合成酶 (Acs) | 催化 | 内源基因，催化乙酸生成乙酰-CoA |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | PHB合成途径 | phaE | PHB合酶亚基E (PhaE) | 催化 | 内源基因，与phaC共同编码PHB合酶，在突变株中被敲除 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | PHB合成途径 | phaC | PHB合酶亚基C (PhaC) | 催化 | 内源基因，与phaE共同编码PHB合酶，在突变株中被敲除 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 正丁醇合成途径（替代） | pduP | CoA-酰化丙醛脱氢酶 (PduP) | 催化 | 异源表达，来自Salmonella enterica，尝试替代AdhE2但表达低 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 正丁醇合成途径（替代） | yqhD | 醇脱氢酶 (YqhD) | 催化 | 异源表达，来自Escherichia coli，与PduP联用 |
关键发现
- 氮饥饿使JA02的比丁醇产量提高达3倍，乙酰-CoA水平增加2倍
- 在氮充足条件下，表达Xfpk使乙酰-CoA提高6倍，丁醇滴度从22 mg/L增至37 mg/L（第8天）。JA04（P_trc）在氮充足/氮饥饿下14天丁醇滴度分别为34和25 mg/L，平均比生产力为1.1和2.7 mg/gDCW/day。JA07（Xfpk过表达）在氮充足条件下比丁醇产量提高2倍，最大比生产力在氮饥饿下为8 mg/gDCW/day。通量平衡分析预测磷酸酮醇酶途径使丁醇ATP成本从35.7降至19.6 mmol ATP/mmol丁醇（降低45%）。
研究结论
磷酸酮醇酶过表达和氮水平调控是提高蓝藻中乙酰-CoA衍生品产量的两种有效策略，可与其他代谢工程策略互补。