Cultivation strategies for production of (R)-3-hydroxybutyric acid from simultaneous consumption of glucose, xylose and arabinose by Escherichia coli
- 作者
- Johan Jarmander, Jaroslav Belotserkovsky, Gustav Sjöberg, Mónica Guevara-Martínez, Mariel Pérez-Zabaleta, Jorge Quillaguamán, Gen Larsson
- 单位
- School of Biotechnology, Division of Industrial Biotechnology, KTH Royal Institute of Technology; Center of Biotechnology, Faculty of Science and Technology, Universidad Mayor de San Simon
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2015）
- DOI
- 10.1186/s12934-015-0236-2
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
木质纤维素废料中约40%的糖为戊糖（木糖和阿拉伯糖），但大多数生产菌株无法有效利用，且野生型大肠杆菌按葡萄糖>阿拉伯糖>木糖的顺序依次消耗糖类，导致戊糖残留和碳源浪费；同时需要实现以混合糖为底物高效生产(R)-3-羟基丁酸(3HB)。
研究策略
利用已构建的能够同时消耗葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的大肠杆菌平台菌株PPA652ara（敲除ptsG并预适应阿拉伯糖），首次将Halomonas boliviensis的3HB合成基因（t3和rx）克隆到该菌株中，通过比较批式、连续、氮耗竭和氮限制补料批式等不同培养模式，设计最佳生产策略以实现高比生产率和高3HB/细胞干重产率。
核心内容
该研究将玻利维亚盐单胞菌的(R)-3-羟基丁酸(3HB)合成基因（t3和rx）首次克隆至大肠杆菌平台菌株PPA652ara中，该菌株因敲除ptsG并经阿拉伯糖预适应而能够同步消耗葡萄糖、木糖和阿拉伯糖三种混合糖。研究者系统比较了批式、连续、氮耗竭及氮限制补料批式等培养模式对3HB生产的影响。结果显示，碳限制条件下3HB比生产率不足2 mg g⁻¹ h⁻¹，而碳过量批式培养可达25 mg g⁻¹ h⁻¹，但3HB/细胞干重产率仅为0.06 g/g；氮耗尽条件下比生产率提升至31 mg g⁻¹ h⁻¹，产率骤增至1.38 g/g；氮限制补料批式模式下比生产率达到最高38 mg g⁻¹ h⁻¹，产率回落至0.16 g/g。氮限制补料批式培养最终3HB产量达1.87 g/L。PPA652ara在所有条件下均同步消耗三种糖，且乙酸积累显著低于野生型AF1000。研究表明，工业过程应分生长期和生产期，产酸期采用氮耗竭或限制策略可将碳通量有效导向3HB，该菌株从混合糖生产3HB的比生产率已与文献中以葡萄糖为底物的大肠杆菌先进水平相当。
创新点
首次在E. coli中异源表达H. boliviensis的3HB合成基因；将同步糖摄取平台与氮耗竭/限制策略结合，显著提高3HB/细胞干重产率；系统比较了碳限制、碳过量、氮耗竭和氮限制补料模式对3HB生产的影响。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli PPA652ara | 糖转运系统（磷酸烯醇丙酮酸：糖磷酸转移酶系统，PTS） | ptsG | EIICBGlc（葡萄糖特异性转运蛋白） | 转运 | 敲除ptsG使诱导物排除机制失活，并提高cAMP水平，从而解除碳代谢物阻遏，实现葡萄糖、木糖和阿拉伯糖同步利用。 |
| Escherichia coli AF1000 | 糖转运系统（磷酸烯醇丙酮酸：糖磷酸转移酶系统，PTS） | ptsG | EIICBGlc（葡萄糖特异性转运蛋白） | 转运 | 野生型对照，具有完整PTS，按顺序消耗糖，且乙酸积累更高。 |
| Escherichia coli（重组菌株，含pJBGT3RX/pJBGRXT3） | (R)-3-羟基丁酸(3HB)生物合成途径 | t3 | 乙酰乙酰辅酶A硫解酶（acetoacetyl-CoA thiolase） | 催化 | 来自Halomonas boliviensis，催化两分子乙酰辅酶A缩合生成乙酰乙酰辅酶A。 |
| Escherichia coli（重组菌株，含pJBGT3RX/pJBGRXT3） | (R)-3-羟基丁酸(3HB)生物合成途径 | rx | 乙酰乙酰辅酶A还原酶（acetoacetyl-CoA reductase） | 催化 | 来自Halomonas boliviensis，将乙酰乙酰辅酶A立体选择性地还原为(R)-3-羟基丁酰辅酶A。 |
| Escherichia coli | 脂肪酸代谢/硫酯水解 | tesB | 硫酯酶II（TesB） | 催化 | 内源硫酯酶，推测将3HB-CoA水解为3HB和CoA，使产物分泌到培养基中。 |
关键发现
- 碳限制条件下3HB比生产率<2 mg g^-1 h^-1；碳过量批式培养时比生产率为25 mg g^-1 h^-1（PPA652ara），但Y3HB/CDW仅为0.06 g/g；氮耗尽条件下比生产率提高至31 mg g^-1 h^-1，Y3HB/CDW达1.38 g/g；氮限制补料批式进一步将比生产率提高到38 mg g^-1 h^-1，但Y3HB/CDW降至0.16 g/g。批式培养中AF1000产3HB
- 51 g/L，PPA652ara产0.31 g/L；氮耗尽阶段AF1000和PPA652ara分别产0.64和0.54 g/L；氮限制补料批式两者分别产1.84和1.87 g/L。PPA652ara在所有条件下同步消耗三种糖，而野生型AF1000不能；PPA652ara乙酸积累显著低于AF1000（连续培养D=0.5 h^-1时为0.78 vs
- 79 g/L；氮限制补料批式最终为0.77 vs
- 66 g/L）。
研究结论
利用E. coli PPA652ara可实现葡萄糖、木糖和阿拉伯糖混合糖的全部消耗并生产3HB。工业生产过程应分为生长期和生产期，在产酸期采用氮耗竭或限制策略可将碳通量导向3HB，显著提高Y3HB/CDW。该菌株从混合糖生产3HB的比生产率与文献中E. coli以葡萄糖为底物的最先进水平相当。