Generation of aroE overexpression mutant of Bacillus megaterium for the production of shikimic acid
- 作者
- Saptarshi Ghosh, Uttam Chand Banerjee
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2015）
- DOI
- 10.1186/s12934-015-0251-3
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
莽草酸是合成抗病毒药物奥司他韦的重要中间体，但传统植物提取和化学合成方法成本高、原料受限，难以满足全球需求。本研究旨在通过代谢工程构建重组菌株，实现莽草酸的微生物发酵生产。
研究策略
将枯草芽孢杆菌MTCC 441的aroE基因克隆至pWH1520载体，通过原生质体转化导入巨大芽孢杆菌MTCC 428中，利用木糖诱导过表达莽草酸脱氢酶，在7 L生物反应器中考察发酵条件，并比较不同碳源对莽草酸产量的影响，最终使用阴离子交换树脂进行分离纯化。
核心内容
莽草酸是合成抗病毒药物奥司他韦的关键前体，传统提取与化学合成法难以满足工业需求。本研究以巨大芽孢杆菌MTCC 428为宿主，将来源于枯草芽孢杆菌MTCC 441的aroE基因克隆至pWH1520载体并转化导入，通过木糖诱导过表达莽草酸脱氢酶，在7 L生物反应器中考察不同碳源对发酵的影响，并利用阴离子交换树脂进行产物纯化。结果显示，重组菌株莽草酸产量达4.2 g/L，而野生型仅为0.53 g/L，脱氢酶总活性提高2.13倍；以果糖为碳源时产量最高达12.54 g/L，产品得率与体积产率分别较野生型提高7.92倍和8倍，最终产品纯度达89%。此外，通过同源建模与分子对接揭示了莽草酸脱氢酶的关键氨基酸残基。研究表明，单一基因过表达即可显著提升莽草酸产量，该重组菌株具备工业应用潜力，果糖为最佳碳源，未来可通过敲除aroK等基因进一步优化。
创新点
首次在巨大芽孢杆菌中通过过表达aroE基因生产莽草酸；构建了枯草芽孢杆菌莽草酸脱氢酶的同源模型并进行了分子对接研究，揭示了关键氨基酸残基；单一基因修饰即可显著提高产量。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Bacillus megaterium MTCC 428 | 莽草酸途径 | aroE | 莽草酸脱氢酶 | 催化 | 过表达来自Bacillus subtilis MTCC 441的aroE基因，用于提高莽草酸产量 |
| Bacillus subtilis MTCC 441 | 莽草酸途径 | aroE | 莽草酸脱氢酶 | 催化 | 作为aroE基因的供体菌株 |
| Escherichia coli Top10 | — | — | — | — | 作为克隆宿主用于质粒构建 |
关键发现
- 在7 L生物反应器中，重组菌株莽草酸产量达4.2 g/L，而野生型仅0.53 g/L
- 莽草酸脱氢酶总活性较野生型提高2.13倍
- 以果糖为碳源时最大产量达12.54 g/L（果糖条件下Y(P/X)=4.04 g/g DCW）
- 分离后产品纯度达89%。与野生型相比，体积产率提高8倍（0.08 g/L/h），产品得率Y(p/S)为21 g/100g（提高7.92倍），细胞量产率提高1.33倍。其他碳源产量：葡萄糖12.21 g/L、乳糖10.95 g/L、麦芽糖12.18 g/L、淀粉6.89 g/L、蔗糖12.30 g/L。
研究结论
过表达aroE基因能显著提高巨大芽孢杆菌的莽草酸产量，果糖是最佳碳源。该重组菌株具有工业应用潜力，未来可通过进一步敲除aroK等基因提升产量。