Identification of enhanced hydrogen and ethanol Escherichia coli producer strains in a glycerol-based medium by screening in single-knock out mutant collections
- 作者
- Antonio Valle, Gema Cabrera, Domingo Cantero, Jorge Bolivar
- 单位
- Department of Biomedicine, Biotechnology and Public Health- Biochemistry and Molecular Biology, Campus de Excelencia Internacional Agroalimentario (ceiA3), Institute of Biomolecules, University of Cádiz; Department of Chemical Engineering and Food Technology, Campus de Excelencia Internacional Agroalimentario (ceiA3), University of Cádiz
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2015）
- DOI
- 10.1186/s12934-015-0285-6
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解决废弃甘油作为碳源时，如何通过遗传改造提高大肠杆菌合成氢气和乙醇的产量，并挖掘新的有利遗传背景。
研究策略
利用Keio和Yale单基因敲除文库进行高通量筛选，在甘油厌氧条件下测定氢气、乙醇产量及甘油消耗，结合统计学分析鉴定优良突变体，并在此基础上构建多基因敲除菌株进一步优化。
核心内容
该研究以废弃甘油为碳源，利用Keio和Yale单基因敲除文库对大肠杆菌BW25113进行高通量筛选，旨在鉴定能提高氢气和乙醇产量的遗传改造靶点。在甘油厌氧条件下测定150个单突变体的目标产物及甘油消耗，结合统计学分析识别出12个先前未报道的有利突变基因，包括gnd、tdcE、rpiA、nanE等。其中gnd突变体在46小时时乙醇和氢气产量分别较野生型提高1.43倍和1.31倍，tdcE突变体在22小时氢气产量提高1.12倍。在此基础上构建的组合菌株M5（敲除ldhA、gnd、frdBC、tdcE）使乙醇摩尔产率提高1.41倍，氢气摩尔产率在70小时和94小时分别提高1.22倍和1.33倍，且22小时甲酸外排量提高2倍。该策略有效挖掘了甘油基培养基中提升产氢产乙醇的新遗传背景，gnd和tdcE突变可作为多基因组合的有利元件，为废甘油资源化利用和代谢工程改造提供新思路。
创新点
建立了适用于甘油厌氧培养的大肠杆菌单突变体高通量筛选体系；首次发现12个与氢气和乙醇生产相关的未报道突变基因；构建了组合突变菌株M5，显著提高摩尔产率。
研究对象（15）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BW25113 | 戊糖磷酸途径 | gnd | 6-磷酸葡糖酸脱氢酶 | 催化 | 敲除后乙醇和氢气产量提高，46h时分别提高1.43和1.31倍 |
| Escherichia coli BW25113 | 苏氨酸降解/丙酮酸代谢 | tdcE | 2-酮丁酸甲酸裂解酶/丙酮酸甲酸裂解酶 | 催化 | 敲除后乙醇和氢气产量提高，46h乙醇提高1.19倍，22h氢气提高1.12倍 |
| Escherichia coli BW25113 | 戊糖磷酸途径 | rpiA | 核糖-5-磷酸异构酶A | 催化 | 敲除后三个目标参数均有提高 |
| Escherichia coli BW25113 | 氨基糖代谢 | nanE | N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸异构酶 | 催化 | 敲除后乙醇、氢气及甘油消耗提高 |
| Escherichia coli BW25113 | 苏氨酸降解 | tdcB | 苏氨酸脱水酶 | 催化 | 敲除后甘油和乙醇产量提高 |
| Escherichia coli BW25113 | 核苷酸代谢 | deoB | 磷酸戊糖变位酶 | 催化 | 敲除后三个目标参数均有提高 |
| Escherichia coli BW25113 | TCA循环 | sucB | 2-氧戊二酸脱氢酶复合物E2组分 | 催化 | 敲除后乙醇产量提高 |
| Escherichia coli BW25113 | 脂多糖生物合成 | cpsG | 磷酸甘露糖变位酶 | 催化 | 敲除后乙醇产量提高 |
| Escherichia coli BW25113 | 甲醛解毒 | frmA | 甲醛脱氢酶 | 催化 | 敲除后甘油消耗提高 |
| Escherichia coli BW25113 | 糖原合成 | glgC | 葡萄糖-1-磷酸腺苷转移酶 | 催化 | 敲除后甘油消耗提高 |
| Escherichia coli BW25113 | TCA循环 | fumA | 延胡索酸酶A | 催化 | 敲除后氢气产量提高 |
| Escherichia coli BW25113 | 谷氨酸代谢 | gadB | 谷氨酸脱羧酶B | 催化 | 敲除后甘油消耗提高 |
| Escherichia coli BW25113 | 乳酸发酵 | ldhA | 乳酸脱氢酶 | 催化 | 用于构建多突变体，敲除以消除乳酸合成 |
| Escherichia coli BW25113 | TCA循环/琥珀酸合成 | frdBC | 延胡索酸还原酶 | 催化 | 用于构建多突变体，敲除以消除琥珀酸合成 |
| Escherichia coli BW25113 | 甲酸转运 | focA | 甲酸转运蛋白FocA | 转运 | 作为对照，敲除后氢气产量提高 |
关键发现
- 筛选150个单突变体，发现12个新突变体（gnd, tdcE, rpiA, nanE, tdcB, deoB, sucB, cpsG, frmA, glgC, fumA, gadB）至少在一个目标产物上优于野生型；gnd突变体在46 h时乙醇和氢气产量分别提高1.43倍和1.31倍；tdcE突变体在46 h乙醇产量提高1.19倍，22 h氢气产量提高1.12倍；组合菌株M5（ldhAgndfrdBCtdcE）乙醇摩尔产率较野生型提高1.41倍，氢气摩尔产率在70 h和94 h分别提高1.22倍和1.33倍；M5在22 h时甲酸外排量提高2倍；pH
- 5条件下乙醇和甘油消耗显著高于pH
- 25。
研究结论
该筛选策略可有效鉴定在甘油基培养基中提高氢气和乙醇产量的大肠杆菌遗传背景，其中gnd和tdcE突变体是多基因组合的有用元件，结合敲除ldhA、frdBC和tdcE可进一步提升产率，为代谢工程改造提供新思路。