Aadh2p: an Arxula adeninivorans alcohol dehydrogenase involved in the first step of the 1-butanol degradation pathway
- 作者
- Marion Rauter, Jakub Kasprzak, Karin Becker, Jan Riechen, Sebastian Worch, Anja Hartmann, Martin Mascher, Uwe Scholz, Kim Baronian, Rüdiger Bode, Frieder Schauer, H. Matthias Vorbrodt, Gotthard Kunze
- 单位
- Orgentis Chemicals GmbH, Bahnhofstr. 3-5, 06466 Gatersleben, Germany; Leibniz Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research (IPK), Corrensstr. 3, 06466 Gatersleben, Saxony-Anhalt, Germany; Jackering Mühlen-und Nährmittelwerke GmbH, Vorsterhauser Weg 46, 59007 Hamm, Germany; School of Biological Sciences, University of Canterbury, Private Bag 4800, Christchurch, New Zealand; Institute of Microbiology, University of Greifswald, Jahnstr. 15, 17487 Greifswald, Germany
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2016）
- DOI
- 10.1186/s12934-016-0573-9
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
鉴定并表征艾氏酵母（Arxula adeninivorans）中参与1-丁醇降解第一步的醇脱氢酶Aadh2p，阐明其在1-丁醇代谢中的作用，为利用该酵母生产1-丁醇提供理论基础和工程靶点。
研究策略
通过基因组挖掘鉴定AADH2基因；利用Xplor®转化表达系统在A. adeninivorans中过表达并纯化重组6h-Aadh2p；测定酶学性质、底物特异性和动力学常数；构建aadh2敲除突变株和过表达菌株，比较其在葡萄糖、乙醇和1-丁醇上的生长及底物消耗；通过qRT-PCR和微阵列分析基因表达调控。
核心内容
本研究从艾氏酵母Arxula adeninivorans中鉴定并表征了参与1-丁醇降解第一步的醇脱氢酶基因AADH2。该基因编码356个氨基酸，重组Aadh2p为约88 kDa的二聚体，定位于细胞质，以NAD(H)为辅因子。酶学分析显示，Aadh2p对1-丁醇和丁醛的催化效率（kcat/KM）分别为4373和23744 (mM·s)^-1，较乙醇和乙醛分别高约42倍和43000倍，且KM值表明其优先氧化1-丁醇并偏向丁醛还原。AADH2在1-丁醇、丙酮酸等非发酵碳源上被强烈诱导（最高约60倍）。敲除aadh2使菌株在1-丁醇上的生长和消耗显著延迟，而过表达AADH2反而因耗尽支链氨基酸（缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸）抑制生长，补充这些氨基酸可恢复。过表达菌株的ADH活性达8000 U/L，约为对照的5.7倍。研究首次阐明Aadh2p是1-丁醇降解途径的关键酶，为利用该酵母高效生产1-丁醇提供了重要靶点，提示需同时敲除其他醇脱氢酶以防止产物氧化。
创新点
首次报道并表征Aadh2p，证明其是1-丁醇降解途径的关键醇脱氢酶，偏向丁醛还原；发现AADH2受非发酵碳源强烈诱导（最高约60倍）；揭示过表达AADH2导致1-丁醇消耗受阻与支链氨基酸代谢相关的现象；提出通过敲除其他ADH并结合AADH2过表达来优化1-丁醇生产的策略。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Arxula adeninivorans LS3 | 1-丁醇降解通路 | AADH2 | Aadh2p | 催化 | 野生型菌株中该基因受1-丁醇等非发酵碳源强烈诱导（表达上调约60倍）。 |
| Arxula adeninivorans G1212 | 1-丁醇降解通路 | AADH2 | Aadh2p | 催化 | 用于构建过表达菌株和敲除突变株G1233；敲除导致1-丁醇消耗减慢。 |
| Arxula adeninivorans G1212/YRC102-AADH2 | 1-丁醇降解通路 | AADH2 | Aadh2p | 催化 | TEF1启动子组成型过表达，YEPD中ADH活性达8000 U/L；但在1-丁醇为唯一碳源时生长受抑，补充支链氨基酸可恢复。 |
| Arxula adeninivorans G1212/YIC102-6H-AADH2 | 1-丁醇降解通路 | AADH2 | 6h-Aadh2p | 催化 | N端His标签重组蛋白用于纯化和酶学表征。 |
| Arxula adeninivorans | 乙醇代谢 | AADH1 | Aadh1p | 催化 | 主要参与乙醇代谢，对1-丁醇降解影响较小，与Aadh2p进行功能比较。 |
| Saccharomyces cerevisiae | 乙醇代谢 | ScADH6, ScADH7, ScADH4 | ScAdh6p, ScAdh7p, ScAdh4p | 催化 | 与Aadh2p进行系统发育比较，Aadh2p与ScAdh4p/6p/7p源于同一祖先节点。 |
| Clostridium acetobutylicum | 丁醇合成 | ADHE2 | AdhE2 | 催化 | 丁醛脱氢酶，背景中提及用于在A. adeninivorans中实现1-丁醇生产。 |
关键发现
- 从Arxula adeninivorans中鉴定到编码356个氨基酸的AADH2基因（ORF 1068 bp），Aadh2p分子量约38.9 kDa，天然形式为约88 kDa的二聚体，定位于细胞质，以NAD(H)为辅因子。纯化的6h-Aadh2p对1-丁醇氧化和丁醛还原的kcat/KM分别为4373和23744 (mM·s)^-1，对乙醇和乙醛分别为99.9和0.6 (mM·s)^-1，即对1-丁醇的催化效率约为乙醇的42倍，对丁醛的催化效率约为乙醛的约43,000倍（原文摘要数据）。KM值：乙醇14.2 mM，乙醛26.5 mM，1-丁醇0.3 mM，丁醛0.5 mM，NAD+
- 5 mM，NADH
- 07 mM。最适pH：还原反应7.5，氧化反应9.0；最适温度45°C。过表达菌株G1212/YRC102-AADH2在YEPD培养基48 h达到最高ADH活性8000 U/L（500 U/g dcw），对照菌株为1400 U/L（200 U/g dcw）。AADH2在1-丁醇诱导下表达上调约58-60倍，在丙酮酸上约61倍，甘油约28倍。aadh2敲除株G1233在1-丁醇为唯一碳源时最大OD600为5，56 h消耗完1-丁醇；对照G1212/YRC102在32 h消耗完；AADH2过表达株在72 h后才开始生长，添加缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸后可恢复生长，48 h消耗完1-丁醇。纯化6h-Aadh2p的比活从0.75提高至2.27 U/mg，纯化倍数3.03倍，回收率32.4%。
研究结论
Aadh2p是A. adeninivorans 1-丁醇降解途径中起主要作用的醇脱氢酶，催化1-丁醇与丁醛之间的转化，且偏向丁醛还原。该基因在非发酵碳源（如1-丁醇、乙醇、甘油、丙酮酸）上显著上调。过表达AADH2会因耗尽支链氨基酸而抑制细胞在1-丁醇上的生长，添加缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸可恢复生长。因此，组成型过表达AADH2有望用于A. adeninivorans生产1-丁醇，但需同时敲除其他醇脱氢酶以防止1-丁醇氧化。