Engineering Escherichia coli to convert acetic acid to β-caryophyllene
- 作者
- Jianming Yang, Qingjuan Nie
- 单位
- Key Lab of Plant Biotechnology in Universities of Shandong Province; College of Life Sciences, Qingdao Agricultural University; Key Lab of Applied Mycology, College of Life Sciences, Qingdao Agricultural University; Foreign Languages School, Qingdao Agricultural University
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2016）
- DOI
- 10.1186/s12934-016-0475-x
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
大肠杆菌在好氧发酵中产生的乙酸副产物会破坏跨膜pH梯度而抑制细胞生长，且乙酸作为废碳降低了碳利用率。本研究旨在构建高效利用乙酸为唯一碳源生产β-石竹烯的工程大肠杆菌，以解决乙酸抑制作用并实现废碳再利用。
研究策略
从不同来源筛选高效的乙酰辅酶A合成酶（ACS）以增强乙酸同化；共表达β-石竹烯合酶（QHS1）和牻牛儿基二磷酸合酶（GPPS2）以合成β-石竹烯；引入异源MVA途径增加IPP/DMAPP前体供应；过表达乙酰乙酰辅酶A合酶（AACS，nphT7）增强乙酰乙酰辅酶A供应；优化有机氮源种类和浓度；在5-L反应器中进行pH耦合乙酸补料分批发酵。
核心内容
该研究通过代谢工程改造大肠杆菌，实现了以乙酸为唯一碳源高效合成倍半萜β-石竹烯，旨在解决乙酸副产物对细胞生长的抑制并提高碳利用率。研究者从多种来源筛选高活性乙酰辅酶A合成酶以强化乙酸同化，共表达来源于青蒿的β-石竹烯合酶QHS1和牻牛儿基二磷酸合酶GPPS2，并引入异源MVA途径以增加前体IPP/DMAPP供应，同时过表达乙酰乙酰辅酶A合酶nphT7强化乙酰辅酶A流向目标产物。摇瓶实验中，引入MVA途径使产量提升约78倍（达8 mg/L），过表达nphT7再提高2.75倍，优化有机氮源后产量达到106 mg/L。最终工程菌株YJM67在5-L补料分批发酵中，72小时β-石竹烯产量达1.05 g/L，生物量12.6 g/L，乙酸到产物的转化效率为理论值的5.6%。这是首次实现以乙酸为唯一碳源生产β-石竹烯，为利用廉价乙酸替代葡萄糖合成萜类化合物提供了可行的代谢工程策略。
创新点
['首次成功利用大肠杆菌以乙酸作为唯一碳源生产β-石竹烯', '构建了从乙酸到β-石竹烯的多步新型生物合成途径，整合了多种异源酶和MVA途径', '引入AACS（nphT7）增强乙酰乙酰辅酶A供应，使β-石竹烯产量较对照提高2.75倍']
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 乙酸利用途径 | acs (ACSEC/ACSST/ACSAP) | acetyl-CoA synthase | 催化 | 筛选了来自大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和巴氏醋杆菌的乙酰辅酶A合成酶，其中ACSAP效率最高，用于高效将乙酸转化为乙酰辅酶A |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜生物合成 | QHS1 | β-caryophyllene synthase | 催化 | 来自黄花蒿，经密码子优化，催化FPP生成β-石竹烯 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 萜类前体合成 | GPPS2 | geranyl diphosphate synthase | 催化 | 来自北美冷杉，催化IPP和DMAPP缩合生成GPP，增强GPP供应 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | MVA途径 | mvaE | acetyl-CoA acetyltransferase/HMG-CoA reductase | 催化 | 来自粪肠球菌，双功能酶，催化乙酰辅酶A缩合及HMG-CoA还原 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | MVA途径 | mvaS | HMG-CoA synthase | 催化 | 来自粪肠球菌，催化乙酰乙酰辅酶A与乙酰辅酶A缩合生成HMG-CoA |
| Escherichia coli BL21(DE3) | MVA途径 | ERG12 | mevalonate kinase | 催化 | 来自酿酒酵母，催化甲羟戊酸磷酸化 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | MVA途径 | ERG8 | phosphomevalonate kinase | 催化 | 来自酿酒酵母，催化甲羟戊酸-5-磷酸进一步磷酸化 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | MVA途径 | ERG19 | mevalonate pyrophosphate decarboxylase | 催化 | 来自酿酒酵母，催化甲羟戊酸焦磷酸脱羧生成IPP |
| Escherichia coli BL21(DE3) | MVA途径 | IDI1 | IPP isomerase | 催化 | 来自酿酒酵母，催化IPP异构化为DMAPP |
| Escherichia coli BL21(DE3) | MVA途径/乙酰乙酰辅酶A合成 | nphT7 | acetoacetyl-CoA synthase | 催化 | 来自Streptomyces sp. CL190，催化乙酰辅酶A与丙二酰辅酶A缩合生成乙酰乙酰辅酶A，不可逆且无硫解活性，增强MVA前体供应 |
关键发现
- 最终工程菌株YJM67在5-L补料分批发酵中，72 h时生物量和β-石竹烯产量分别达到12.6 g/L和1.05 g/L，比生产力为1.15 mg h^-1 g^-1干细胞，乙酸转化为β-石竹烯的转化效率（克对克）达2.1%，约为理论产率的5.6%。摇瓶条件下引入MVA途径使YJM66产量达8±0.75 mg/L，是仅用MEP途径的YJM64（102±9 μg/L）的约78倍（原文表述为eight-fold）
- 引入AACS( nphT7 )使YJM67（24 h，60 mM乙酸）产量达22±1.8 mg/L，为YJM66的2.75倍
- 优化氮源（5 g/L Solarbio牛肉浸膏）后产量进一步达106±9.6 mg/L，约为优化前（22±1.8 mg/L）的5倍。
研究结论
通过代谢工程改造大肠杆菌，构建了以乙酸为唯一碳源合成β-石竹烯的全新生物合成途径，最终菌株YJM67能够高效积累β-石竹烯。这是首次成功实现以乙酸为唯一碳源进行β-石竹烯生产，为利用廉价乙酸替代葡萄糖生产β-石竹烯及其他生化品提供了新的代谢工程策略。