A new regulatory mechanism controlling carotenogenesis in the fungus Mucor circinelloides as a target to generate β-carotene over-producing strains by genetic engineering
- 作者
- Yingtong Zhang, Eusebio Navarro, José T. Canovas-Marquez, Lorena Almagro, Haiqin Chen, Yong Q. Chen, Hao Zhang, Santiago Torres-Martinez, Wei Chen, Victoriano Garre
- 单位
- State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Food Science and Technology, Jiangnan University; Departamento de Genética y Microbiología (Associate Unit to IQFR-CSIC), Facultad de Biología, Universidad de Murcia; Beijing Innovation Centre of Food Nutrition and Human Health, Beijing Technology and Business University (BTBU); Department of Plant Biology, Faculty of Biology, University of Murcia
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2016）
- DOI
- 10.1186/s12934-016-0493-8
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析Mucor circinelloides中控制类胡萝卜素生物合成的新型调控机制，并通过遗传工程构建β-胡萝卜素高产菌株。
研究策略
结合正向遗传学（NTG/UV诱变筛选颜色突变体）和反向遗传学（全基因组测序、基因敲除、基因表达分析）方法，分析34个类胡萝卜素合成突变体，在MU206和MU218背景中敲除已知抑制因子crgA，研究其对β-胡萝卜素含量的影响并探索未知调控途径。
核心内容
通过正向遗传学（化学/紫外诱变筛选颜色突变体）结合反向遗传学（全基因组测序与基因表达分析），对34个卷枝毛霉类胡萝卜素合成突变体进行了系统解析。作者在已知结构基因carB、carRP及调控基因mcwc-1c、mcwc-2均无突变的8个突变体中，发现了独立于已知抑制因子crgA的新型负调控途径。在MU206和MU218两个高产背景下分别敲除crgA，获得的MU606菌株在暗处和光下β-胡萝卜素产量分别达到3001.9 μg/g和4009.2 μg/g干重，约为野生型（8.6和170.8 μg/g）的5倍，是单敲除菌株MU221的2倍，其中carB和carRP的mRNA水平分别提高至野生型的27倍和25倍（暗处）。全基因组测序显示MU206仅含一个预测蛋白的A125V错义突变，而MU218携多个突变。该工作不仅揭示了不依赖crgA的类胡萝卜素合成抑制新机制，还构建出MU606这一极具工业化潜力的β-胡萝卜素高产菌株。
创新点
首次提出M. circinelloides中存在一个与crgA平行且独立的新型类胡萝卜素合成负调控机制；利用全基因组测序对突变体进行系统鉴定；通过crgA敲除和MU218背景叠加获得β-胡萝卜素产量显著提高的菌株MU606（最高约4 mg/g干重）。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Mucor circinelloides | 类胡萝卜素生物合成 | carB | 植物烯脱氢酶（推定） | 催化 | 类胡萝卜素结构基因，突变导致白色表型，如MU260等 |
| Mucor circinelloides | 类胡萝卜素生物合成 | carRP | 植物烯合酶/番茄红素环化酶（推定双功能酶） | 催化 | 类胡萝卜素结构基因，参与八氢番茄红素合成及环化，突变导致白色或浅黄色表型 |
| Mucor circinelloides | 类胡萝卜素生物合成调控 | crgA | CrgA（RING finger蛋白，推测E3泛素连接酶） | 调控 | 类胡萝卜素生物合成负调控因子，其缺失使β-胡萝卜素过量积累，敲除后mRNA水平显著升高 |
| Mucor circinelloides | 光诱导类胡萝卜素合成调控 | mcwc-1c | Mcwc-1c（White Collar-1同源蛋白） | 调控 | 光诱导类胡萝卜素合成所必需，其缺失导致光诱导β-胡萝卜素增加仅3倍（野生型为21倍） |
| Mucor circinelloides | 类胡萝卜素生物合成调控 | mcwc-1b | Mcwc-1b（White Collar-1同源蛋白） | 调控 | CrgA通过单泛素化和双泛素化（但不降解）抑制其活性，非泛素化时激活carB和carRP转录 |
| Mucor circinelloides | 光诱导类胡萝卜素合成调控 | mcwc-2（ID78608, ID85699, ID153812, ID157130） | Mcwc-2（White Collar-2同源蛋白，推定） | 调控 | 推定的光调控相关基因，在34个突变体中未检测到突变 |
关键发现
- 筛选得到34个颜色突变体，其中8个在已知类胡萝卜素结构基因（carB、carRP）和调控基因（mcwc-1c、mcwc-2）中无突变，提示存在未知调控因子。MU206和MU218在黑暗中β-胡萝卜素含量分别为81.6 μg/g和63.1 μg/g，而野生型仅8.6 μg/g
- 光照下分别为254.7 μg/g和736.1 μg/g，野生型为170.8 μg/g。在MU218中敲除crgA获得的MU606在暗处和光下β-胡萝卜素含量分别达3001.9 μg/g和4009.2 μg/g（约3 mg/g和4 mg/g），约为野生型的5倍和crgA单敲除菌株MU221（暗处1481.8 μg/g、光下2003.1 μg/g）的2倍。MU206的crgA敲除株MU611在光下最高达2879.0 μg/g。MU606的carB mRNA水平在暗处为野生型的27倍、光下为6倍，carRP mRNA水平分别为25倍和15倍。全基因组测序显示MU206仅有一个预测蛋白基因错义突变（A125V），MU218则含有多个基因突变。
研究结论
M. circinelloides中存在新的、独立于crgA的类胡萝卜素合成负调控机制，该机制通过降低类胡萝卜素结构基因（carB、carRP）的mRNA水平来抑制合成。在MU218背景下同时敲除crgA可显著提高β-胡萝卜素产量，所得菌株MU606是极具潜力的β-胡萝卜素工业生产候选菌株。