Integrated analysis of gene expression and metabolic fluxes in PHA-producing Pseudomonas putida grown on glycerol
- 作者
- Veronique Beckers, Ignacio Poblete-Castro, Jürgen Tomasch, Christoph Wittmann
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2016）
- DOI
- 10.1186/s12934-016-0470-2
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
解析恶臭假单胞菌KT2440在甘油为唯一碳源时，碳/氮限制条件下生长与中链聚羟基脂肪酸酯（mcl-PHA）合成相关的基因表达与代谢通量耦合机制，为理性改造提高PHA产量提供系统生物学基础。
研究策略
利用精确调控的恒化培养结合生长动力学和化学计量学，测定维持能系数和真实得率；通过转录组和代谢通量分析比较碳限制与氮限制、高/低稀释率下的差异；采用通量平衡分析和基本通量模式分析评估代谢网络潜力并预测工程靶点。
核心内容
本研究以恶臭假单胞菌KT2440为对象，在甘油唯一碳源条件下系统解析了碳/氮限制与细胞生长和mcl-PHA合成之间的基因表达与代谢通量耦合关系。通过恒化培养结合生长动力学、化学计量学、转录组和代谢通量分析，并采用通量平衡分析和基本通量模式分析评估代谢网络潜力。结果显示该菌在甘油上的维持能系数仅0.039 mmol甘油/(g CDW·h)，约为大肠杆菌的1/16；氮限制低稀释率(0.044 h-1)下PHA含量达29.7 wt%，高稀释率下为12.8 wt%。氮限制下ED途径通量比碳限制高2.1-3.9倍，TCA循环活性高1.8-3.3倍，PHA合成通量最高提升20倍，PAS/PAC传感器基因表达上调超30倍。基本通量模式分析识别出ED途径、PP途径为过表达靶点，TCA循环和副产物途径为下调靶点，表明PHA合成主要受前体供应而非ATP限制，为理性工程改造提高PHA产量提供了明确方向。
创新点
['首次定量了恶臭假单胞菌KT2440在甘油上的维持能系数，发现其远低于其他细菌，具有商业应用潜力', '整合转录组与通量组数据，系统揭示了氮限制下ED途径、乙醛酸支路和丙酮酸代谢对PHA合成的贡献', '利用基本通量模式分析识别了提高PHA产量的代谢工程靶点，包括ED途径和乙醛酸支路的调控策略']
研究对象（13）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pseudomonas putida KT2440 | 甘油代谢 | glpR | GlpR转录调控因子 | 调控 | 甘油利用的转录抑制子，失活可提高mcl-PHA合成 |
| Pseudomonas putida KT2440 | 甘油代谢 | glpF | GlpF通道蛋白 | 转运 | MIP家族通道蛋白，负责甘油跨膜转运 |
| Pseudomonas putida KT2440 | 甘油代谢 | glpK | 甘油激酶 | 催化 | 磷酸化甘油为甘油-3-磷酸 |
| Pseudomonas putida KT2440 | 甘油代谢 | glpD | 甘油-3-磷酸脱氢酶 | 催化 | 催化甘油-3-磷酸氧化为磷酸二羟丙酮 |
| Pseudomonas putida KT2440 | Entner-Doudoroff途径 | eda | KDPG醛缩酶 | 催化 | ED途径关键酶，裂解KDPG为甘油醛-3-磷酸和丙酮酸 |
| Pseudomonas putida KT2440 | 戊糖磷酸途径 | zwf | 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 | 催化 | 产生NADPH，为PHA合成提供还原力 |
| Pseudomonas putida KT2440 | PHA合成 | phaC1 | PHA聚合酶 | 催化 | 催化羟基酰基-CoA聚合成PHA链 |
| Pseudomonas putida KT2440 | PHA合成 | phaG | 脂酰转移酶 | 催化 | 连接脂肪酸从头合成与PHA合成，氮限制下显著上调 |
| Pseudomonas putida KT2440 | PHA合成 | phaI, phaF | phasin蛋白 | 区室化 | PHA颗粒相关蛋白，参与颗粒形成与分布 |
| Pseudomonas putida KT2440 | 能量代谢 | PP_2675, PP_4323, PP_4324 | 细胞色素c型蛋白 | 能量供给 | 电子传递链组分，影响细胞能量状态 |
| Pseudomonas putida KT2440 | 调控网络 | PP_2664 | PAS/PAC传感组氨酸激酶 | 调控 | 感知细胞能量水平，氮限制下表达上调超30倍 |
| Pseudomonas putida KT2440 | 调控网络 | PP_2671 | 整合膜传感器 | 调控 | 参与能量状态感应，氮限制下显著上调 |
| Pseudomonas putida KT2440 | 调控网络 | PP_2672 | LuxR家族调控因子 | 调控 | 与能量代谢相关基因的表达调控 |
关键发现
- 恶臭假单胞菌KT2440在甘油上的维持能系数为0.039 mmol甘油/(g CDW·h)，约为大肠杆菌的1/16，真实生长得率为0.505 g/g
- 在氮限制、低稀释率(0.044 h-1)下PHA含量达29.7 wt% CDW，高稀释率(0.12 h-1)下为12.8 wt% CDW
- 低稀释率下副产物为琥珀酸和苹果酸，高稀释率下仅苹果酸
- 氮限制下ED途径通量比碳限制高2.1倍(高稀释率)和3.9倍(低稀释率)，TCA循环活性高1.8倍和3.3倍，PHA合成通量高7倍和20倍
- PAS/PAC传感器基因(PP_2664和PP_2671)在氮限制下表达上调超过30倍
- 通过基本通量模式分析获得1533个唯一模式，预测ED途径、PP途径和EMP前三个反应为过表达靶点，TCA循环部分、乙醛酸支路和副产物合成途径为下调/敲除靶点。
研究结论
研究表明，恶臭假单胞菌KT2440在甘油上合成mcl-PHA时，ED途径、乙醛酸支路和丙酮酸代谢是关键代谢节点，PHA合成主要受前体供应而非ATP限制；通过代谢工程改造ED途径、TCA循环和脂肪酸从头合成相关基因有望显著提高PHA产量。