Overexpression of a bifunctional enzyme, CrtS, enhances astaxanthin synthesis through two pathways in Phaffia rhodozyma
- 作者
- Shuang Chi, Yanfeng He, Jie Ren, Qian Su, Xingchao Liu, Zhi Chen, Mingan Wang, Ying Li, Jilun Li
- 单位
- State Key Laboratories for Agro-biotechnology, College of Biological Sciences, China Agricultural University; Department of Applied Chemistry, College of Sciences, China Agricultural University
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2015）
- DOI
- 10.1186/s12934-015-0279-4
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
鉴定突变株MK19中未知类胡萝卜素（HDCO）并进一步提高虾青素产量，探索CrtS在双环和单环类胡萝卜素合成途径中的作用。
研究策略
在虾青素高产突变株MK19中过表达编码虾青素合酶的双功能酶基因crtS，构建无抗生素标记的稳定重组菌株，并分析类胡萝卜素组成、转录水平和发酵性能。
核心内容
该研究在虾青素高产突变株Phaffia rhodozyma MK19中过表达编码虾青素合酶的双功能酶基因crtS，构建了无抗生素标记的稳定重组菌株CSR19及其质粒型对照CS19。MK19胞内虾青素含量已比野生型高17倍，在此基础上过表达crtS使重组菌CSR19的最大虾青素产量达25.3 mg/L，较MK19提高33.5%，虾青素占总类胡萝卜素比例达84%；CS19产量为21.2 mg/L，提高11.8%。转录分析显示crtS表达水平提高7至16倍，同时上调crtE、crtYB、crtI等类胡萝卜素合成基因的转录（分别提高3至12倍、4至13倍和2至14倍）。在7.5-L生物反应器中，CSR19最大虾青素产量达27.8 mg/L，比摇瓶MK19提高47.1%，虾青素浓度达1200 μg/g细胞干重，且HDCO比例在稳定期下降约30%。该工作首次证明CrtS具有双功能酶活性，可催化HDCO转化为虾青素，提出包含双环和单环途径的合成方案，所构建的稳定无抗性标记菌株适合作为饲料添加剂生产菌株，为理解类胡萝卜素代谢通量调控提供了新见解。
创新点
首次在MK19中发现CrtS具有双功能酶活性，可催化HDCO转化为虾青素；构建了稳定且无抗性标记的菌株CSR19；提出包含双环和单环途径的虾青素合成新方案。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Phaffia rhodozyma (Xanthophyllomyces dendrorhous) 菌株MK19 | 类胡萝卜素生物合成（双环和单环途径） | crtS | 虾青素合酶（CrtS） | 催化 | 双功能酶，催化β-胡萝卜素向虾青素的转化，并促进HDCO转化为虾青素；过表达后转录水平提高7-16倍。 |
| Phaffia rhodozyma (Xanthophyllomyces dendrorhous) 菌株MK19 | 类胡萝卜素生物合成 | crtE | 香叶基香叶基焦磷酸（GGPP）合酶 | 催化 | 催化IPP/FPP合成GGPP，过表达CrtS后转录水平提高3-12倍。 |
| Phaffia rhodozyma (Xanthophyllomyces dendrorhous) 菌株MK19 | 类胡萝卜素生物合成 | crtYB | 八氢番茄红素合酶/番茄红素环化酶 | 催化 | 双功能酶，催化八氢番茄红素合成及番茄红素环化，过表达CrtS后转录水平提高4-13倍。 |
| Phaffia rhodozyma (Xanthophyllomyces dendrorhous) 菌株MK19 | 类胡萝卜素生物合成 | crtI | 八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | 参与八氢番茄红素脱氢，过表达CrtS后转录水平提高2-14倍。 |
| Phaffia rhodozyma (Xanthophyllomyces dendrorhous) 菌株MK19 | 类胡萝卜素生物合成 | crtR | 细胞色素P450还原酶（CPR） | 能量供给 | 为CrtS提供电子以完成氧化反应，支持虾青素合成。 |
关键发现
- MK19胞内虾青素含量比野生型高17倍
- 过表达crtS的重组菌CSR19最大虾青素产量为25.3 mg/L，比MK19提高33.5%，虾青素占总类胡萝卜素比例达84%
- CS19产量为21.2 mg/L，提高11.8%
- 质粒拷贝数CS19为9.1、CSR19为8.2
- 细胞干重分别提高36.5%和12.2%
- crtS转录水平提高7-16倍，crtE提高3-12倍，crtYB提高4-13倍，crtI提高2-14倍
- 在7.5-L生物反应器中CSR19最大虾青素产量为27.8 mg/L，比摇瓶MK19高47.1%，虾青素浓度达1200 μg/g细胞干重
- HDCO比例在稳定期下降约30%，虾青素比例相应增加。
研究结论
CrtS过表达会上调类胡萝卜素合成相关基因（crtE、crtYB、crtI）的转录水平，从而增加虾青素产量；菌株CSR19稳定、安全，适合作为饲料添加剂生产菌株。研究结果有助于阐明P. rhodozyma类胡萝卜素生物合成途径中代谢通量的调控机制。