Characterisation of the broad substrate specificity 2-keto acid decarboxylase Aro10p of Saccharomyces kudriavzevii and its implication in aroma development
- 作者
- Jiri Stribny, Gabriele Romagnoli, Roberto Pérez-Torrado, Jean-Marc Daran, Amparo Querol
- 单位
- Food Biotechnology Department, Institute of Agrochemistry and Food Technology (IATA-CSIC); Department of Biotechnology, Delft University of Technology; Kluyver Centre for Genomics of Industrial Fermentation, Delft; Platform Green Synthetic Biology, Delft
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2016）
- DOI
- 10.1186/s12934-016-0449-z
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析Saccharomyces kudriavzevii中具有广谱底物特异性的2-酮酸脱羧酶Aro10p的酶学特性，并探索其能否用于改善Saccharomyces cerevisiae的香气化合物（高级醇和乙酸酯）生产能力。
研究策略
利用Grantham矩阵对S. kudriavzevii和S. cerevisiae中参与氨基酸分解代谢的23个酶进行序列比对，筛选出氨基酸替换最剧烈的候选基因ARO10；在S. cerevisiae中将内源ARO10替换为S. kudriavzevii的SkARO10，比较高级醇和酯类的产量；并在2-酮酸脱羧酶缺失的宿主菌株中比较SkAro10p和ScAro10p的底物特异性和动力学参数。
核心内容
该研究对酿酒酵母近缘种Saccharomyces kudriavzevii中的2-酮酸脱羧酶Aro10p进行了功能表征，并探索其在香气化合物生产中的应用潜力。研究者通过Grantham矩阵对两种酵母中23个氨基酸分解代谢酶进行序列比对，筛选出氨基酸替换最剧烈的ARO10基因，并在酿酒酵母中将内源ARO10替换为SkARO10。结果显示，以缬氨酸为氮源时，表达SkARO10的菌株异丁基乙酸酯产量约为对照的9倍；以亮氨酸为氮源时，异戊醇和异戊基乙酸酯分别提高约2倍和3.6倍。酶动力学测定发现，SkAro10p对苯丙酮酸的Km为0.07 mM，低于ScAro10p的0.15 mM，且对所有测试底物的活性大致相当，而ScAro10p明显偏好苯丙酮酸。该研究表明SkAro10p具有更均衡的底物偏好性，异源表达可显著提升多种高级醇和乙酸酯的产量，为改善发酵产物香气复杂性提供了新策略。
创新点
首次对S. kudriavzevii的Aro10p进行功能表征，发现其底物偏好性与S. cerevisiae Aro10p显著不同；通过异源表达SkARO10显著提高了异丁醇、异戊醇及其乙酸酯的产量，为改善工业酵母风味提供了新策略。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae Ta (T73衍生单倍体) | Ehrlich pathway (氨基酸分解代谢) | ARO10 | Aro10p | 催化 | 内源ARO10被替换为SkARO10得到JET01Sk，回补得到JET01Sc |
| Saccharomyces kudriavzevii IFO1802 | Ehrlich pathway (氨基酸分解代谢) | SkARO10 | SkAro10p | 催化 | 供体基因，编码广谱底物2-酮酸脱羧酶 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK711-7C (pdc1Δ pdc5Δ pdc6Δ aro10Δ thi3Δ) | Ehrlich pathway (氨基酸分解代谢) | SkARO10 / ScARO10 | SkAro10p / ScAro10p | 催化 | 用于酶活性测定的宿主菌株，分别表达SkARO10和ScARO10 |
| Saccharomyces cerevisiae | Ehrlich pathway (氨基酸分解代谢) | ATF1 | Atf1p | 催化 | 醇乙酰转移酶，合成乙酸酯，虽未直接实验但被列为候选 |
| Saccharomyces cerevisiae | Ehrlich pathway (氨基酸分解代谢) | ATF2 | Atf2p | 催化 | 醇乙酰转移酶，合成乙酸酯，被列为候选 |
| Saccharomyces cerevisiae | Ehrlich pathway (氨基酸分解代谢) | SFA1 | Sfa1p | 催化 | 双功能酶：甲醛脱氢酶和醇脱氢酶，被列为候选 |
关键发现
- 在缬氨酸为氮源时，表达SkARO10的JET01Sk菌株异丁基乙酸酯产量约为JET01Sc的9倍
- 以亮氨酸为氮源时，异戊醇和异戊基乙酸酯分别提高约2倍和3.6倍。酶动力学测定显示，SkAro10p对苯丙酮酸的Km为0.07±0.005 mM，Vmax为6.95±0.15 nmol min⁻¹ (mg protein)⁻¹，而ScAro10p的Km为0.15±0.01 mM，Vmax为21.7±0.5 nmol min⁻¹ (mg protein)⁻¹。SkAro10p对所有测试底物（苯丙酮酸、酮异己酸、酮异戊酸、酮甲基戊酸、4-甲硫基-2-氧代丁酸）的活性大致相当，而ScAro10p明显偏好苯丙酮酸。Grantham分析显示Aro10p有11个激进替换，总激进替换分数为1629。
研究结论
S. kudriavzevii的Aro10p与S. cerevisiae Aro10p在氨基酸序列上的差异导致其底物偏好和酶动力学性质不同，SkAro10p能更均衡地脱羧多种2-酮酸，从而在S. cerevisiae中表达时增加多种高级醇和乙酸酯的产量，具有改善发酵产物香气复杂性的应用潜力。