ATP citrate lyase mediated cytosolic acetyl-CoA biosynthesis increases mevalonate production in Saccharomyces cerevisiae

作者: Sarah Rodriguez, Charles M. Denby, T. Van Vu, Edward E. K. Baidoo, George Wang, Jay D. Keasling
单位: Joint BioEnergy Institute, Emeryville, CA, USA; Physical Biosciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA, USA; California Institute of Quantitative Biosciences (QB3), University of California, Berkeley, CA, USA; Department of Bioengineering, University of California, Berkeley, CA, USA; Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of California, Berkeley, CA, USA
杂志: Microbial Cell Factories（2016）
DOI: 10.1186/s12934-016-0447-1
所属领域: 代谢工程
关键词: ATP citrate lyaseAcetyl Coenzyme AIsoprenoid synthesisMetabolic engineeringMevalonate pathwaySaccharomyces cerevisiae
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解决的核心问题

酿酒酵母中细胞质乙酰辅酶A供应受限于内源PDH旁路途径，难以持续将糖转化为乙酰辅酶A衍生化学品，导致甲羟戊酸等目标产物产量不高。

研究策略

通过在酿酒酵母中异源表达ATP柠檬酸裂解酶（ACL），并采用push/pull/block策略：敲除线粒体NAD+依赖性异柠檬酸脱氢酶（IDH1）以增加柠檬酸向细胞质的转运，共表达粪肠球菌mvaE和mvaS基因增强甲羟戊酸途径的'拉力'，并用铜可阻遏的CTR3启动子替换内源ERG12启动子以阻断甲羟戊酸下游消耗，从而提高甲羟戊酸产量。

研究路线图

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核心内容

该研究在酿酒酵母中重建了由异源ATP柠檬酸裂解酶（ACL）介导的细胞质乙酰辅酶A合成途径，以解决内源旁路供应不足的问题。通过系统筛选构巢曲霉、小鼠、解脂耶氏酵母等来源的ACL，发现构巢曲霉来源活性最高，其表达使柠檬酸水平在低氮条件下降低35%。在此基础上整合push/pull/block策略：敲除线粒体IDH1以增强柠檬酸外流、共表达粪肠球菌mvaE/mvaS强化甲羟戊酸途径拉力、用铜阻遏型CTR3启动子替换ERG12启动子阻断下游消耗。结果显示，在IDH1敲除背景下共表达ACL和mvaE/mvaS使甲羟戊酸和角鲨烯产量分别提升137%和445%，约为基础产量的3倍；进一步结合启动子替换后最终甲羟戊酸产量超过30 mg/L。该工作证明ACL介导的细胞质乙酰辅酶A供给结合push/pull/block策略可显著提升乙酰辅酶A衍生化学品的产量，为类似产物的代谢工程改造提供了通用方案。

创新点

首次在酿酒酵母中重建并证明ACL介导的细胞质乙酰辅酶A合成途径可有效提升甲羟戊酸产量；系统比较了多种来源ACL活性，发现构巢曲霉ACL活性最高；将push/pull/block策略整合用于甲羟戊酸终产物生产，而非传统异戊二烯衍生物。

研究对象（6）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
Saccharomyces cerevisiae	乙酰辅酶A合成/柠檬酸代谢	AnACLα/AnACLb	ATP citrate lyase (ACL)	催化	来自构巢曲霉（Aspergillus nidulans），异源表达，催化柠檬酸裂解为乙酰辅酶A和草酰乙酸，活性最高
Saccharomyces cerevisiae	三羧酸循环	IDH1	NAD+依赖性异柠檬酸脱氢酶（调控亚基）	催化	敲除该基因以阻断异柠檬酸氧化脱羧，使柠檬酸积累并向细胞质转运，增加ACL底物供应
Saccharomyces cerevisiae	甲羟戊酸途径	mvaE	MvaE（乙酰乙酰-CoA硫解酶/HMG-CoA还原酶双功能蛋白）	催化	来自粪肠球菌，整合表达，催化乙酰辅酶A生成甲羟戊酸的前体步骤
Saccharomyces cerevisiae	甲羟戊酸途径	mvaS	MvaS（HMG-CoA合酶）	催化	来自粪肠球菌，整合表达，与mvaE共同催化乙酰辅酶A向甲羟戊酸途径的碳流
Saccharomyces cerevisiae	甲羟戊酸途径	ERG12	甲羟戊酸激酶	催化	用铜可阻遏的CTR3启动子替换其天然启动子，降低表达以减少甲羟戊酸下游消耗，属于'block'策略
Saccharomyces cerevisiae	基因表达调控	CTR3启动子	无	调控	铜可阻遏启动子，用于替换ERG12的启动子以调控甲羟戊酸激酶表达

关键发现

从构巢曲霉、小鼠、解脂耶氏酵母、红冬孢酵母和油脂酵母等来源筛选ACL，其中构巢曲霉ACL活性最高，约比其他活性来源高一个数量级。表达ACL使柠檬酸水平在标准氮和低氮条件下分别降低39%和35%
低氮条件下柠檬酸水平比标准氮高70%。在IDH1敲除株中表达ACL使柠檬酸降低46%，甲羟戊酸增加96%。在IDH1Δ背景中共表达ACL和mvaE/mvaS，甲羟戊酸和角鲨烯产量分别比仅表达mvaE/mvaS的菌株增加137%和445%，甲羟戊酸产量约提高3倍。进一步用CTR3启动子替换ERG12启动子，结合ACL表达和IDH1敲除，最终甲羟戊酸产量超过30 mg/L。

研究结论

通过组合ACL表达、IDH1敲除和ERG12启动子替换的push/pull/block策略，显著提高了酿酒酵母的甲羟戊酸产量，证明该策略可作为改善乙酰辅酶A衍生燃料和化学品生产效率的通用方法。