Using global transcription machinery engineering (gTME) to improve ethanol tolerance of Zymomonas mobilis
- 作者
- Furong Tan, Bo Wu, Lichun Dai, Han Qin, Zongxia Shui, Jingli Wang, Qili Zhu, Guoquan Hu, Mingxiong He
- 单位
- Biogas Institute of Ministry of Agriculture, Biomass Energy Technology Research Centre; Key Laboratory of Development and Application of Rural Renewable Energy, Ministry of Agriculture
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2016）
- DOI
- 10.1186/s12934-015-0398-y
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
微生物宿主对高浓度乙醇的耐受性低，导致生物燃料发酵效率受限，尤其是运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）在乙醇胁迫下生长和产乙醇能力下降。
研究策略
利用全局转录机制工程（gTME），通过易错PCR对编码主要sigma因子σ70的rpoD基因进行随机突变，构建突变文库，并以逐步升高的乙醇浓度（7%、8%、9%）进行富集筛选，获得乙醇耐受性提高的突变株。
核心内容
该研究针对运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）在高浓度乙醇胁迫下生长和发酵效率低的问题，首次将全局转录机制工程（gTME）应用于该菌株。研究者通过易错PCR对编码主要sigma因子σ70的rpoD基因进行随机突变，构建突变文库，并逐步提高乙醇浓度（7%、8%、9%）进行富集筛选，获得4株乙醇耐受性提高的突变株（ZM4-mrpoD1~4）。其中ZM4-mrpoD4耐受性最佳，在9%乙醇胁迫22h后其葡萄糖消耗速率达约1.77 g/L/h，而对照仅为1.39 g/L/h；培养54h后残留葡萄糖仅为初始的0.64%，对照为5.43%。在9%乙醇胁迫下，ZM4-mrpoD4的净乙醇产量为13.0-14.1 g/L，接近对照的两倍。该突变株在24h和48h的丙酮酸脱羧酶活性分别为62.23和68.42 U/g，为对照的2.6和1.6倍；pdc基因相对表达量在9%乙醇胁迫下较对照提高9.0-12.7倍。回补实验证明rpoD突变是表型改善的直接原因。研究表明RpoD是Z. mobilis抵抗高浓度乙醇的重要调控因子，gTME为改造复杂表型提供了有效新途径。
创新点
首次将gTME策略应用于Zymomonas mobilis，通过改造全局转录因子RpoD显著增强其乙醇耐受性；结合回补实验证明突变rpoD是表型改善的原因；发现RpoD在抵抗高浓度乙醇胁迫中发挥重要作用。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Zymomonas mobilis ZM4 | Entner-Doudoroff (ED) pathway | rpoD | RNA聚合酶sigma因子σ70 | 调控 | 全局转录因子，通过易错PCR引入突变（如Q57L、G426C、I448N）提高乙醇耐受性 |
| Zymomonas mobilis ZM4 | 乙醇发酵途径 | pdc | 丙酮酸脱羧酶 (PDC) | 催化 | 9%乙醇胁迫下表达量显著上调，24h和48h活性分别提高2.6和1.6倍 |
| Zymomonas mobilis ZM4 | 乙醇发酵途径 | adhB | 乙醇脱氢酶 (ADH) | 催化 | 9%乙醇胁迫下活性提高1.4和1.3倍，基因表达在24h下调约0.5倍 |
关键发现
- 从易错PCR文库中筛选到4个乙醇耐受突变株（ZM4-mrpoD1~4），其中ZM4-mrpoD4耐受性最佳。在9%（v/v）乙醇胁迫22h后，ZM4-mrpoD4、回补菌株ZM4-imrpoD和对照菌株的葡萄糖消耗速率分别为约1.77、1.78和1.39 g/L/h
- 培养54h后残留初始葡萄糖分别为0.64%和5.43%。在9%乙醇胁迫下，ZM4-mrpoD4和ZM4-imrpoD在30-54h的净乙醇产量为13.0-14.1 g/L，而对照仅为6.6-7.7 g/L。ZM4-mrpoD4的丙酮酸脱羧酶（PDC）活性在24h和48h分别为62.23和68.42 U/g，是对照的2.6和1.6倍
- 乙醇脱氢酶（ADH）活性分别提高1.4和1.3倍。qPCR显示，9%乙醇胁迫6h和24h时，ZM4-mrpoD4中pdc基因相对表达量较对照分别提高9.0倍和12.7倍。
研究结论
RpoD的突变能够显著增强Zymomonas mobilis的乙醇耐受性，改善其在乙醇胁迫下的葡萄糖利用和乙醇生产能力。全局转录机制工程（gTME）为改造复杂表型（如乙醇耐受性）提供了一种有效的新途径，RpoD是Z. mobilis抗高浓度乙醇的重要调控因子。