Engineered Zymomonas mobilis for salt tolerance using EZ-Tn5-based transposon insertion mutagenesis system
- 作者
- Jing-Li Wang, Bo Wu, Han Qin, Yang You, Song Liu, Zong-Xia Shui, Fu-Rong Tan, Yan-Wei Wang, Qi-Li Zhu, Yan-Bin Li, Zhi-Yong Ruan, Ke-Dong Ma, Li-Chun Dai, Guo-Quan Hu, Ming-Xiong He
- 单位
- Key Laboratory of Development and Application of Rural Renewable Energy (Ministry of Agriculture), Biomass Energy Technology Research Centre, Biogas Institute of Ministry of Agriculture, Section 4-13, Renmin Nanlu, Chengdu 610041, People's Republic of China; Xinjiang Production and Construction Corps Key Laboratory of Protection and Utilization of Biological Resources, College of Life Sciences, Tarim University, Tarim Basin, Alaer City 843300, People's Republic of China; Key Laboratory of Microbial Resources (Ministry of Agriculture, China), Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, CAAS, Beijing 100081, People's Republic of China; College of Environmental and Chemical Engineering, Dalian University, Dalian 116622, People's Republic of China
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2016）
- DOI
- 10.1186/s12934-016-0503-x
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
盐胁迫对Zymomonas mobilis细胞生长和乙醇产量有不利影响，导致糖转化率下降，需要提高其耐盐性以满足工业需求。
研究策略
利用EZ-Tn5转座子插入突变系统构建Z. mobilis ZM4突变文库，在含1% NaCl的RM平板上筛选耐盐突变株，通过基因组步移定位插入位点，并进一步通过基因敲除验证himA基因功能。
核心内容
针对盐胁迫对运动发酵单胞菌ZM4生长和乙醇产量的不利影响，该研究采用EZ-Tn5转座子插入突变系统构建了约200个突变体，在含1% NaCl的平板上筛选出耐盐突变株ZMT2，并通过基因组步移定位插入位点为himA基因（ZMO1122）。在2% NaCl胁迫下，ZMT2发酵66小时残糖浓度为5.30%，远低于野生型ZM4的16.75%和himA基因敲除株Δ1122的22.50%，乙醇产量达6.83 g/L，高于后两者的5.46和5.14 g/L。1.5% NaCl条件下，ZMT2在10小时几乎耗尽葡萄糖，而ZM4和Δ1122仅利用约69.70%和67.15%。qPCR显示2% NaCl下ZMT2的adhB和pdc表达分别达ZM4的8.13倍和4.62倍；无盐条件下ZMT2的NADH/NAD+比值为ZM4的4.93倍。himA基因在盐胁迫下表达上调约3.18倍。结果表明himA破坏可增强菌株耐盐性和乙醇发酵能力，证实了Tn5转座子系统在菌株改良和抗性基因挖掘中的有效性。
创新点
首次在Z. mobilis中应用EZ-Tn5转座子插入突变系统构建耐盐菌株；首次发现himA基因参与NaCl胁迫响应；验证了Tn5转座子突变系统在菌株改良和抗性基因挖掘中的可行性。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Zymomonas mobilis ZM4 | 乙醇发酵途径（Entner-Doudoroff途径） | himA (ZMO1122) | HimA（整合宿主因子亚基α） | 调控 | Tn5转座子插入或基因敲除破坏himA可提高耐盐性，可能涉及DNA修复与重组调控 |
| Zymomonas mobilis ZM4 | 乙醇发酵途径 | pdc | PDC（丙酮酸脱羧酶） | 催化 | 2% NaCl下ZMT2中pdc表达显著高于ZM4，酶活性测定显示不同盐浓度下活性变化 |
| Zymomonas mobilis ZM4 | 乙醇发酵途径 | adhB | ADHB（乙醇脱氢酶B） | 催化 | 2% NaCl下ZMT2和Δ1122的adhB表达分别是对照的8.13和32.03倍，酶活性随盐浓度增加而升高 |
| Zymomonas mobilis ZM4 | NADH/NAD+代谢 | — | — | 能量供给 | NADH/NAD+比值在无盐时ZMT2和Δ1122显著高于ZM4，盐胁迫下普遍降低，与耐盐性相关 |
关键发现
- 构建了约200个Z. mobilis ZM4突变体，筛选到耐盐突变株ZMT2（CGMCC 11888）。在2% NaCl胁迫下，ZMT2发酵66h后残糖浓度为5.30%，远低于ZM4的16.75%和Δ1122的22.50%
- 乙醇产量分别为6.83、5.46和5.14 g/L。在1.5% NaCl下，10h时ZMT2几乎耗尽葡萄糖，而ZM4和Δ1122仅利用69.70%和67.15%
- 15h乙醇产量分别为7.29、6.54和6.97 g/L。himA基因在ZM4中于1.5% NaCl时表达上调3.18±0.88，约为0%、1%、2% NaCl时的6倍。qPCR显示2% NaCl下ZMT2和Δ1122的adhB表达分别是ZM4的8.13倍和32.03倍，pdc表达分别是ZM4的4.62倍和9.63倍。无盐条件下ZMT2和Δ1122的NADH/NAD+比值分别为ZM4的4.93倍和11.74倍。
研究结论
通过Tn5转座子插入突变系统成功获得耐盐性提高的Z. mobilis ZMT2菌株，其插入位点位于himA基因（ZMO1122），himA基因的破坏增强了菌株在NaCl胁迫下的糖转化和乙醇生产能力。研究表明himA参与盐胁迫响应，Tn5转座子突变系统是Z. mobilis菌株改良和抗性基因挖掘的有效工具。