Combinatory optimization of chromosomal integrated mevalonate pathway for β-carotene production in Escherichia coli
- 作者
- Lijun Ye, Chunzhi Zhang, Changhao Bi, Qingyan Li, Xueli Zhang
- 单位
- School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University; Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences; Key Laboratory of Systems Microbial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2016）
- DOI
- 10.1186/s12934-016-0607-3
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
质粒表达异源MVA途径不稳定且对宿主生长造成负担，需要构建遗传稳定且表达平衡的MVA途径以提升β-胡萝卜素产量。
研究策略
将MVA途径划分为三个模块，将两个异源操纵子（Hmg1-erg12和mvaS-mvaA-mvaD1）整合到E. coli染色体，利用不同强度启动子和RBS库对模块进行转录和翻译水平的组合调控。
核心内容
针对质粒表达异源甲羟戊酸（MVA）途径易丢失且加重宿主负担的问题，该研究将MVA途径拆分为三个模块，并将两个异源操纵子（Hmg1-erg12与mvaS-mvaA-mvaD1）整合到大肠杆菌染色体上，利用不同强度的启动子和RBS文库在转录与翻译水平对模块进行组合调控。结果显示，用M1-37启动子激活内源atoB基因使β-胡萝卜素产量较对照菌株CAR001提高26%；通过RBS文库优化mvaS和Hmg1，最佳菌株Hmg1-RBSL-M10的产量达到CAR001的1.51倍，且细胞质量基本不变。相比之下，质粒表达导致细胞量下降12%至27%，且90%的质粒菌株在24小时内丧失抗生素抗性，而染色体整合菌株中100%的菌落保持橙色表型，证明遗传稳定性显著提升。该工作表明，通过染色体整合与多层级表达调控实现异源途径的平衡表达，可在不影响生长的前提下有效提升产物合成，为构建遗传稳定的高产菌株提供了可行策略。
创新点
['将异源MVA途径基因整合到染色体并采用组合调控策略', '在转录和翻译水平同时优化途径基因表达', '构建了同时具有高效MEP和MVA途径的遗传稳定底盘菌株']
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | MVA pathway | atoB | 乙酰辅酶A乙酰转移酶 | 催化 | 内源基因，用M1-37启动子调控增强表达 |
| Escherichia coli | MVA pathway | mvaS | HMG-CoA合酶 | 催化 | 来自酿酒酵母，RBS库调控 |
| Escherichia coli | MVA pathway | Hmg1 | 截短的HMG-CoA还原酶 | 催化 | 来自酿酒酵母，与erg12组成操纵子，RBS库调控 |
| Escherichia coli | MVA pathway | erg12 | 甲羟戊酸激酶 | 催化 | 来自酿酒酵母，与Hmg1组成操纵子 |
| Escherichia coli | MVA pathway | mvaA | HMG-CoA还原酶 | 催化 | 来自酿酒酵母，与mvaS、mvaD1组成操纵子 |
| Escherichia coli | MVA pathway | mvaD1 | 甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶 | 催化 | 来自酿酒酵母，与mvaS、mvaA组成操纵子 |
| Escherichia coli | MEP pathway | dxs | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 | 催化 | 在CAR001中被激活 |
| Escherichia coli | MEP pathway | idi | IPP异构酶 | 催化 | 在CAR001中被激活 |
| Escherichia coli | β-胡萝卜素合成 | crtEXYIB | β-胡萝卜素合成酶系（CrtE、CrtX、CrtY、CrtI、CrtB） | 催化 | 来自Pantoea agglomerans，整合于染色体 |
| Escherichia coli | 异戊二烯前体合成 | ispA | 法尼基焦磷酸合酶 | 催化 | 内源基因，参与FPP合成 |
关键发现
- 通过激活atoB基因（用M1-37启动子）使β-胡萝卜素产量比CAR001提高26%
- 通过RBS库组合调控mvaS和Hmg1，最佳菌株Hmg1-RBSL-M10的β-胡萝卜素产量比CAR001提高51%（为CAR001的1.51倍），细胞质量为CAR001的0.99倍
- mvaS-RBSL-13比CAR001提高36%，比亲本CAR012提高8%。质粒表达导致细胞量下降12%和27%，且90%质粒菌株在24小时内丧失抗性
- 染色体整合后100%菌落保持橙色（遗传稳定）。
研究结论
通过染色体整合和转录/翻译水平的组合调控，实现了MVA途径的平衡表达，显著提高了β-胡萝卜素产量，并获得了遗传稳定的工程菌株，为异源途径优化提供了新策略。