\(^{13}\mathrm{C}\) -metabolic flux analysis of ethanol-assimilating Saccharomyces cerevisiae for S-adenosyl-L-methionine production
- 作者
- Kenshi Hayakawa, Fumio Matsuda, Hiroshi Shimizu
- 单位
- Department of Bioinformatic Engineering, Graduate School of Information Science and Technology, Osaka University; KANEKA Fundamental Technology Research Alliance Laboratories, Graduate School of Engineering, Osaka University; Biotechnology Development Laboratories, Health Care Solutions Research Institute, Kaneka Corporation
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2018）
- DOI
- 10.1186/s12934-018-0935-6
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
乙醇添加可提高酿酒酵母中S-腺苷-L-蛋氨酸（SAM）的积累，但乙醇同化条件下的代谢机制尚不清楚，需要定量解析中心碳代谢通量的变化。
研究策略
通过计算机模拟优化13C标记实验设计，采用100% [2-13C]乙醇作为碳源进行13C-代谢通量分析（13C-MFA），比较乙醇与葡萄糖培养条件下的代谢通量分布，并结合ATP/NADPH平衡及细胞内代谢物浓度测定。
核心内容
该研究以酿酒酵母Kyokai no. 6为对象，首次采用13C-代谢通量分析定量解析乙醇同化条件下中心碳代谢的重塑机制。通过计算机模拟优化示踪物选择，确定以100% [2-13C]乙醇为碳源进行化学恒化培养，并与葡萄糖培养对比，结合ATP/NADPH平衡估算及胞内代谢物浓度测定。结果显示，乙醇培养下SAM含量达1.8 mg/gCDW，为葡萄糖培养（0.58 mg/gCDW）的3.1倍，比生产速率提升约3倍。通量分析发现乙醛酸支路通量从葡萄糖下的0.007–0.03 mmol/gCDW/h大幅升至0.58–0.68 mmol/gCDW/h，线粒体异柠檬酸脱氢酶通量也由0.34–0.42升至0.91–1.1 mmol/gCDW/h，表明TCA循环成为主要NADPH来源。ATP平衡估算显示乙醇下ATP再生与消耗差值（5.1 mmol/gCDW/h）为葡萄糖（2.8 mmol/gCDW/h）的1.9倍，胞内ATP浓度相应提高1.4倍。这些结果证明乙醇同化通过激活氧化磷酸化和乙醛酸支路产生过量ATP，为SAM积累提供能量驱动，该机制对利用酿酒酵母生产以胞质乙酰-CoA为前体的产品具有指导意义。
创新点
首次对乙醇同化的酿酒酵母进行13C-MFA；通过模拟确定[2-13C]乙醇为最佳示踪物，提高了TCA循环和戊糖磷酸途径通量估算精度；揭示了乙醇同化下乙醛酸支路和TCA循环通量上调，增强氧化磷酸化产生过量ATP，从而促进SAM积累。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae Kyokai no. 6 (NBRC2346) | 乙醛酸支路 | ICL1, ICL2 | 异柠檬酸裂解酶 | 催化 | 乙醇培养下通量0.58–0.68 mmol/gCDW/h，较葡萄糖（0.007–0.03）显著上调 |
| Saccharomyces cerevisiae Kyokai no. 6 (NBRC2346) | 乙醛酸支路 | MLS1, MLS2 | 苹果酸合酶 | 催化 | 乙醇生长必需，催化乙醛酸与乙酰-CoA缩合生成苹果酸 |
| Saccharomyces cerevisiae Kyokai no. 6 (NBRC2346) | TCA循环 | — | 异柠檬酸脱氢酶（NADP+） | 催化 | 乙醇下通量0.91–1.1 mmol/gCDW/h，为NADPH主要来源；葡萄糖下仅0.34–0.42 |
| Saccharomyces cerevisiae Kyokai no. 6 (NBRC2346) | 丙酮酸代谢 | — | 丙酮酸羧化酶 | 催化 | 乙醇下通量0.42–1.4 mmol/gCDW/h，补充胞质草酰乙酸 |
| Saccharomyces cerevisiae Kyokai no. 6 (NBRC2346) | 乙醇代谢 | ALD4, ALD6 | 乙醛脱氢酶 | 催化 | 乙醇下乙酸盐比生产速率29 μmol/gCDW/h，远高于葡萄糖的4.9 |
| Saccharomyces cerevisiae Kyokai no. 6 (NBRC2346) | 丙酮酸脱氢酶复合体 | PDA1, PDB1, PDX1, LPD1 | 丙酮酸脱氢酶复合体 | 催化 | 乙醇下通量极低（0–0.06 mmol/gCDW/h），可能受NADH变构抑制 |
| Saccharomyces cerevisiae Kyokai no. 6 (NBRC2346) | 乙酰辅酶A合成 | — | 乙酰辅酶A合酶 | 催化 | 乙醇下通量2.5–2.6 mmol/gCDW/h，葡萄糖下0.13–0.43，为L-甲硫氨酸合成提供乙酰-CoA |
关键发现
- 在稀释率0.06 h^-1的化学恒化培养中，乙醇培养下SAM含量为1.8 mg/gCDW（葡萄糖为0.58 mg/gCDW），SAM比生产速率为0.27 μmol/gCDW/h（葡萄糖为0.089 μmol/gCDW/h）
- 乙醇消耗速率为2.5 mmol/gCDW/h，生物量产率（12 gCDW/mol C）低于葡萄糖（15 gCDW/mol C）。13C-MFA显示乙醇培养下乙醛酸支路通量（异柠檬酸→乙醛酸+琥珀酸）为0.58–0.68 mmol/gCDW/h，而葡萄糖下仅0.007–0.03 mmol/gCDW/h
- 线粒体异柠檬酸脱氢酶（IDH）通量在乙醇下为0.91–1.1 mmol/gCDW/h，葡萄糖下为0.34–0.42 mmol/gCDW/h，表明TCA循环提供主要NADPH。ATP平衡估算显示乙醇下ATP再生与消耗的差值（5.1 mmol/gCDW/h）是葡萄糖（2.8 mmol/gCDW/h）的1.9倍。另一实验中，乙醇培养的细胞内ATP浓度为24.8±1.6 μmol/gCDW，葡萄糖为17.5±2.6 μmol/gCDW（1.4倍）
- L-甲硫氨酸浓度乙醇下0.10±0.0019 μmol/gCDW，葡萄糖下0.060±0.0024 μmol/gCDW（1.7倍）
- 细胞内SAM浓度乙醇下1.2±0.067 μmol/gCDW，葡萄糖下1.0±0.12 μmol/gCDW（1.2倍）。
研究结论
乙醇同化通过激活氧化磷酸化产生过量ATP，是SAM高积累的关键机制；该机制可为利用酿酒酵母生产以胞质乙酰-CoA为前体的产品提供指导。