Efficient production of 1,3-propanediol from crude glycerol by repeated fed-batch fermentation strategy of a lactate and 2,3-butanediol deficient mutant of Klebsiella pneumoniae
- 作者
- Baek-Rock Oh, Sung-Mok Lee, Sun-Yeon Heo, Jeong-Woo Seo, Chul Ho Kim
- 单位
- Microbial Biotechnology Research Center, Jeonbuk Branch Institute, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB), Jeonbuk, Jeongeup 580-185, Republic of Korea; Korea Institute of Ocean Science and Technology, Busan 49111, Republic of Korea
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2018）
- DOI
- 10.1186/s12934-018-0921-z
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何通过菌株改造和发酵策略优化，实现从粗甘油高效生产1,3-丙二醇（1,3-PDO），同时降低副产物（乳酸、2,3-丁二醇）的积累，提高产量和生产率，并降低生产成本。
研究策略
以肺炎克雷伯氏菌ΔldhA突变体为底盘，敲除乳酸脱氢酶基因消除乳酸生成；进一步敲除2,3-丁二醇合成途径关键基因（als、adc、ard）构建双突变体。采用重复补料分批发酵策略，优化玉米浆浓度、接种量、培养基替换比例和pH等条件，实现高浓度、高生产率的1,3-PDO生产。
核心内容
本研究以肺炎克雷伯氏菌为底盘，通过基因工程改造消除副产物合成途径并结合发酵策略优化，实现从粗甘油高效生产1,3-丙二醇（1,3-PDO）。首先敲除乳酸脱氢酶基因获得ΔldhA突变体，再分别敲除2,3-丁二醇（2,3-BDO）合成途径中的关键基因als、adc、ard构建系列双突变体。在优化条件下，ΔldhA经重复补料分批发酵5个循环，产量稳定在79.9–80.5 g/L，最大产量达81.1 g/L，生产率为3.38 g/L/h。比较不同敲除靶点发现，敲除als能将2,3-BDO与1,3-PDO产物比例从50.6%降至20.3%（9.97 g/L对49.1 g/L），而敲除adc虽完全消除2,3-BDO但严重抑制生长，产量仅17.96 g/L。以Δ(ldhA als)组合在pH 6.5下重复补料发酵可获得57.7 g/L产量和2.40 g/L/h生产率。此外，用1%玉米浆替代1 g/L酵母提取物，产率可达理论最大值的69.4%，显著降低培养基成本。结果表明，敲除als的双突变株结合重复补料分批策略，可在降低副产物的同时保持较高产量，具备良好的工业化应用潜力。
创新点
['首次采用重复补料分批发酵策略用于肺炎克雷伯氏菌ΔldhA突变体生产1,3-PDO，显著提高生产率和产量，并稳定维持五个循环。', '用玉米浆替代酵母提取物作为氮源，降低培养基成本。', '系统比较了敲除2,3-丁二醇合成途径中不同基因（als、adc、ard）对菌株生长、副产物积累和1,3-PDO生产的影响，确定了Δ(ldhA als)为最优双突变菌株。', '发现敲除adc完全消除2,3-BDO但严重抑制生长，而敲除als可将2,3-BDO比例降至约20%，同时保留较高产量。']
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Klebsiella pneumoniae | 甘油还原途径 | dhaB | 甘油脱水酶（DhaB） | 催化 | 将甘油转化为3-羟基丙醛（3-HPA） |
| Klebsiella pneumoniae | 甘油还原途径 | dhaT | 1,3-丙二醇氧化还原酶（DhaT） | 催化 | 将3-HPA还原为1,3-PDO |
| Klebsiella pneumoniae | 甘油氧化途径 | dhaD | 甘油脱氢酶（DhaD） | 催化 | 将甘油氧化为二羟丙酮（DHA） |
| Klebsiella pneumoniae | 甘油氧化途径 | dhaK | 二羟丙酮激酶（DhaK） | 催化 | 将DHA磷酸化为磷酸二羟丙酮（DHAP） |
| Klebsiella pneumoniae | 副产物代谢（乳酸合成） | ldhA | 乳酸脱氢酶（LdhA） | 催化 | 催化丙酮酸生成乳酸，敲除该基因可完全消除乳酸产生 |
| Klebsiella pneumoniae | 2,3-丁二醇合成途径 | als | 乙酰乳酸合成酶（Als） | 催化 | 催化丙酮酸生成乙酰乳酸，其缺失使2,3-BDO比例降至约20% |
| Klebsiella pneumoniae | 2,3-丁二醇合成途径 | adc | 乙酰乳酸脱羧酶（Adc） | 催化 | 催化乙酰乳酸生成乙偶姻，其缺失完全消除2,3-BDO但严重抑制生长 |
| Klebsiella pneumoniae | 2,3-丁二醇合成途径 | ard | 乙偶姻还原酶（Ard） | 催化 | 催化乙偶姻生成2,3-BDO，其缺失后仍产生(2S,3S)-型2,3-BDO |
关键发现
- 在优化的重复补料分批发酵条件下，ΔldhA突变株最大1,3-PDO产量达81.1 g/L，生产率为3.38 g/L/h，且五个循环中产量稳定在79.9-80.5 g/L、生产率3.32-3.35 g/L/h。使用Δ(ldhA als)双突变株后，2,3-BDO与1,3-PDO的比例从50.6%（ΔldhA的40.4 g/L vs
- 9 g/L）降至20.3%（9.97 g/L vs
- 1 g/L），但1,3-PDO产量下降61.4%。在pH
- 5下重复补料分批发酵Δ(ldhA als)可获得最高1,3-PDO
- 7 g/L和生产率2.40 g/L/h。CSL优化实验显示1%玉米浆可替代1 g/L酵母提取物，1,3-PDO产量为8.2 g/L，产率可达理论最大值的69.4%。此外，Δ(ldhA adc)突变体完全消除2,3-BDO但生长严重受损，1,3-PDO仅17.96 g/L；Δ(ldhA ard)产生2,3-BDO
- 59 g/L和1,3-PDO
- 24 g/L。
研究结论
重复补料分批发酵策略结合敲除乳酸和2,3-丁二醇合成途径的基因工程改造，可显著提高1,3-PDO的生产率和产量，同时减少副产物，降低生产成本，具有良好的工业化应用前景。其中Δ(ldhA als)突变株在降低2,3-BDO的同时仍保有较高产量，是较优的工业生产菌株。