Improved ethanol productivity from lignocellulosic hydrolysates by Escherichia coli with regulated glucose utilization
- 作者
- Jinfeng Sun, Kangming Tian, Jie Wang, Zixing Dong, Xiaoguang Liu, Kugenthiren Permaul, Suren Singh, Bernard A. Prior, Zhengxiang Wang
- 单位
- Center for Bioresource and Bioenergy, School of Biotechnology, Jiangnan University; Department of Biological Chemical Engineering, College of Chemical Engineering and Materials Science, Tianjin University of Science and Technology; School of Life Science and Food Engineering, Huaiyin Institute of Technology; Department of Biotechnology and Food Technology, Durban University of Technology; Department of Microbiology, University of Stellenbosch
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2018）
- DOI
- 10.1186/s12934-018-0915-x
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
木质纤维素水解物中混合糖高效同时利用困难，尤其是大肠杆菌优先利用葡萄糖导致的碳代谢物阻遏（CCR）使得木糖等非葡萄糖糖类利用滞后，影响乙醇生产效率与原料经济性。
研究策略
构建葡萄糖利用受温度调控的工程大肠杆菌：敲除pta-ackA、ldhA、pflB阻断副产物形成，敲除ptsG、glk、manZ阻断葡萄糖摄取与代谢，并将ptsG置于温度诱导型λpR/pL启动子控制下，再引入携带Zymomonas mobilis pdc和adhB的质粒pEtac-PA构建乙醇途径；采用“两阶段-两温度”策略（34°C有氧生长、42°C兼性厌氧发酵），实现生长阶段关闭葡萄糖利用、发酵阶段开启葡萄糖利用。
核心内容
该研究构建了一株葡萄糖利用受温度调控的工程大肠杆菌，以解决木质纤维素水解物中混合糖共发酵时因碳代谢物阻遏导致的木糖等非葡萄糖糖类利用滞后问题。研究者敲除了pta-ackA、ldhA和pflB阻断副产物生成，敲除ptsG、glk和manZ破坏葡萄糖摄取与磷酸化，并将ptsG置于温度诱导型λpR/pL启动子控制下，同时引入运动发酵单胞菌的pdc和adhB基因构建乙醇合成途径。采用两阶段两温度策略，在34°C有氧生长阶段关闭葡萄糖利用、消除碳代谢物阻遏，使菌株优先利用木糖等非葡萄糖糖类；在42°C兼性厌氧发酵阶段开启葡萄糖利用，实现所有糖类的高效共发酵。摇瓶实验中，42°C发酵18小时消耗50 g/L葡萄糖并产生24.3 g/L乙醇，产率达48.4 g/100 g葡萄糖。在7-L生物反应器以玉米芯水解物为原料，12小时内将260.9 g混合糖转化为127.7 g乙醇，乙醇生产率4.06 g/(L·h)，总糖消耗速率8.28 g/(L·h)，均显著高于对照菌株。该温度开关策略有效解决了混合糖同步利用难题，为木质纤维素乙醇生产提供了更具经济可行性的工艺方案。
创新点
1. 首次利用温度可诱导启动子调控ptsG表达，实现大肠杆菌葡萄糖利用的“可逆开关”；2. 生长阶段关闭葡萄糖利用，彻底消除CCR，使菌株优先利用木糖、阿拉伯糖、半乳糖等非葡萄糖糖类；3. 发酵阶段开启葡萄糖利用，实现了所有糖类的高效共发酵产乙醇，显著提高乙醇生产率和糖消耗速率。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli B0013-2021HPA | 葡萄糖转运 | ptsG | PtsG (EIICBGlc) | 转运 | 受温度诱导型λpR/pL启动子控制，低温不表达，高温表达，实现葡萄糖利用开关 |
| Escherichia coli B0013-2021HPA | 葡萄糖转运 | manZ | ManZ (IIDMan) | 转运 | 敲除，阻断甘露糖PTS途径对葡萄糖的摄取 |
| Escherichia coli B0013-2021HPA | 葡萄糖磷酸化 | glk | Glk (glucokinase) | 催化 | 敲除，阻断葡萄糖磷酸化，与ptsG、manZ共同阻断葡萄糖利用 |
| Escherichia coli B0013-2021HPA | 乙酸合成途径 | pta-ackA | PTA-ACKA | 催化 | 敲除，阻断乙酸生成，减少碳损失 |
| Escherichia coli B0013-2021HPA | 乳酸合成途径 | ldhA | LDHA | 催化 | 敲除，阻断乳酸生成 |
| Escherichia coli B0013-2021HPA | 甲酸合成途径 | pflB | PFLB | 催化 | 敲除，阻断甲酸生成 |
| Escherichia coli B0013-2021HPA | 乙醇发酵途径 | pdc, adhB | PDC, ADHII | 催化 | 来自运动发酵单胞菌，由质粒pEtac-PA表达，负责将丙酮酸转化为乙醇 |
| Escherichia coli B0013-2021HPA | 木糖转运 | xylH | XylH | 转运 | 恢复功能，用于木糖转运，支持生长阶段木糖利用 |
| Escherichia coli B0013-2021HPA | 琥珀酸/延胡索酸代谢 | frdA | FrdA | 催化 | 敲除并作为ptsG表达盒的整合位点 |
| Escherichia coli B0013-2021HPA | 温度调控系统 | cI857 | cI857 repressor | 调控 | 温度敏感阻遏物，低温抑制λpR/pL启动子，高温失活从而启动ptsG转录 |
关键发现
- 在摇瓶发酵中，B0013-2021HPA在34°C以5 g/L木糖生长，葡萄糖浓度保持约50 g/L恒定
- 42°C发酵18 h后，50 g/L葡萄糖全部消耗并产生24.3 g/L乙醇，乙醇产率48.4 g/100 g葡萄糖，葡萄糖消耗速率3.08 g/(L·h)
- 在7-L生物反应器中，以玉米芯水解物为原料，采用两阶段两温度策略，12 h内将260.9 g混合糖转化为127.7 g乙醇，乙醇生产率4.06 g/(L·h)，总糖消耗速率8.28 g/(L·h)
- 对照菌B0013-1031HPA的乙醇生产率为2.85 g/(L·h)，糖消耗速率5.81 g/(L·h)。此外，42°C时ptsG转录水平较对照高6倍以上，PTase活性约高3倍。
研究结论
通过温度开关调控葡萄糖利用，成功开发了一种高效利用木质纤维素水解物中混合糖生产乙醇的新工艺，显著提高了乙醇生产率和糖消耗速率，并改善了木质纤维素乙醇生产的经济可行性。