A novel bi-directional promoter system allows tunable recombinant protein production in Pichia pastoris
- 作者
- Vignesh Rajamanickam, Karl Metzger, Christian Schmid, Oliver Spadiut
- 单位
- Research Division Biochemical Engineering, Institute of Chemical, Environmental and Biological Engineering, TU Wien, Gumpendorfer Strasse 1a, 1060 Vienna, Austria; Christian Doppler Laboratory for Mechanistic and Physiological Methods for Improved Bioprocesses, Institute of Chemical, Environmental and Biological Engineering, TU Wien, Vienna, Austria; bisy e.U., Wetzawinkel 20A, 8200 Hofstaetten/Raab, Austria
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2017）
- DOI
- 10.1186/s12934-017-0768-8
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
现有毕赤酵母启动子系统（如组成型P_GAP和甲醇诱导型P_AOX1）缺乏可调性，难以实现对两个基因的独立调控与精细调节，且甲醇诱导存在安全性和操作限制。
研究策略
构建由改良过氧化氢酶启动子P_DC（去阻遏且可诱导）和传统甲醇诱导启动子P_AOX1组成的双向启动子系统，利用不同碳源（甘油/甲醇）及混合补料策略，通过动态补料调控重组蛋白表达，并在生物反应器中进行生理表征。
核心内容
本研究在毕赤酵母中构建并表征了一种由去阻遏型过氧化氢酶启动子P_DC与甲醇诱导型启动子P_AOX1组成的双向启动子系统，旨在解决现有启动子缺乏可调性、难以独立调控双基因表达且依赖甲醇诱导的问题。通过在不同碳源组合（甘油、甲醇及混合补料）条件下进行生物反应器生理表征，系统评估了该启动子系统对重组纤维二糖水解酶CBH2表达的影响。结果表明，甘油批次中最大比生长速率为0.27 h⁻¹，混合补料条件下（甘油比摄取速率0.059 g g⁻¹ h⁻¹、甲醇比摄取速率0.024 g g⁻¹ h⁻¹）产物比生成速率达0.372 mg g⁻¹ h⁻¹，较仅甲醇条件下提高约1.5倍，较无甲醇时相同甘油速率下提高约5倍；最优条件下产物比生成速率最高达0.573 mg g⁻¹ h⁻¹，且甲醇适应时间仅3小时，全程无甲醇积累。该研究首次验证了仅通过碳源组成即可实现双向启动子对蛋白表达的可调控制，为毕赤酵母中双基因协调表达提供了灵活工具。
创新点
['首次在毕赤酵母中构建并表征P_DC/P_AOX1双向启动子系统', '仅通过碳源组成即可实现重组蛋白表达的可调性', '混合补料策略显著提高生产率，并缩短甲醇适应时间', '为双向启动子在毕赤酵母中的应用提供概念验证']
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia pastoris BSYBG11 | 甲醇利用途径 | AOX1 | — | 调控 | AOX1编码基因已缺失，但保留其启动子P_AOX1用于驱动重组基因表达，受甲醇诱导 |
| Pichia pastoris BSYBG11 | 过氧化物酶体功能 | 过氧化氢酶基因（CAT） | Catalase | 调控 | P_DC为过氧化氢酶基因上游500 bp片段，既受碳源去阻遏又可被甲醇诱导，是双向启动子的一个方向 |
| Pichia pastoris BSYBG11 | 重组蛋白表达 | — | Cellobiohydrolase 2 (CBH2) | 催化 | 来自Trichoderma reesei的模型酶，克隆于P_DC和P_AOX1下游，用于评估双向启动子的可调性 |
| Pichia pastoris BSYBG11 | 蛋白质分泌 | MFα1（alpha-mating factor前导序列） | α-mating factor pre-pro signal peptide | 转运 | 用于引导CBH2分泌到胞外，使细胞外蛋白即为目标产物 |
关键发现
- 甘油批次中最大比生长速率μ_max=0.27 h⁻¹，最大甘油比摄取速率q_s,max,gly=0.57 g g⁻¹ h⁻¹，生物量产率Y_X/S=0.47 g g⁻¹。FB1中P_DC启动子在甘油条件下始终有活性，在q_s,gly=0.28 g g⁻¹ h⁻¹时q_p达到最高0.492 mg g⁻¹ h⁻¹
- 甲醇适应时间仅3 h。FB2中混合补料（q_s,gly=0.059 g g⁻¹ h⁻¹，q_s,MeOH=0.024 g g⁻¹ h⁻¹）时q_p达0.372 mg g⁻¹ h⁻¹，比仅甲醇（q_p=0.115 mg g⁻¹ h⁻¹）高约1.5倍，比无甲醇时相同q_s,gly下（q_p=0.073 mg g⁻¹ h⁻¹）高约5倍。FB3中获得最高q_p=0.573 mg g⁻¹ h⁻¹（q_s,gly=0.135 g g⁻¹ h⁻¹，q_s,MeOH=0.035 g g⁻¹ h⁻¹）。所有实验中未检测到甲醇积累，碳平衡闭合验证数据有效。SDS-PAGE显示CBH2为主要分泌蛋白（约60 kDa）。
研究结论
本研究首次在受控生物反应器中验证了由P_DC和P_AOX1组成的新型双向启动子系统，证明该系统可仅通过碳源（甘油/甲醇）组合实现重组蛋白表达的可调性，为毕赤酵母中双基因协调表达和生物过程开发提供了高度灵活的工具。