Biomarkers allow detection of nutrient limitations and respective supplementation for elimination in Pichia pastoris fed-batch cultures
- 作者
- Jonas Burgard, Minoska Valli, Alexandra B. Graf, Brigitte Gasser, Diethard Mattanovich
- 单位
- Austrian Centre of Industrial Biotechnology; Department of Biotechnology, BOKU-University of Natural Resources and Life Sciences; School of Bioengineering, University of Applied Sciences FH Campus Vienna
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2017）
- DOI
- 10.1186/s12934-017-0730-9
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
在毕赤酵母补料分批培养中，高细胞密度和重组蛋白生产导致硫、磷、氮等营养限制，影响细胞生长和重组蛋白产量，传统培养基无法满足需求，缺乏有效的检测和补救手段。
研究策略
利用转录组学分析葡萄糖和甲醇限制性补料分批培养过程中的基因表达变化，鉴定营养限制相关的生物标志物基因；随后在培养过程中补充相应营养盐（硫酸铵、磷酸氢二铵），通过qPCR验证标志基因的转录水平变化，并评估对生物量和重组蛋白产量的影响。
核心内容
该研究针对毕赤酵母高密度补料分批培养中因硫、磷、氮等营养限制而影响细胞生长和重组蛋白产量的问题，提出了一种基于转录标志物检测和定向营养补充的策略。通过对葡萄糖和甲醇限制性补料培养过程中的转录组进行分析，作者系统鉴定了与硫、磷、氮限制相关的标志基因，例如磷限制的标志基因PHO84和硫限制相关基因JLP1-1等。在培养晚期，PHO84转录上调最高达约89倍，JLP1-1上调约35倍。随后，作者在培养过程中分别补充硫酸铵或磷酸氢二铵，通过qPCR验证了标志基因转录水平回落，表明营养限制在转录水平被消除。补充硫酸铵使生物量增加5%、羧肽酶B活性提高52%，最终效价从对照组的136 mg/L提升至206 mg/L；补充磷酸氢二铵使生物量增加9%、酶活性提高60%，效价达到217 mg/L。该工作证明营养限制标志基因可用于实时监测培养状态，为毕赤酵母培养基设计和过程优化提供了通用工具，尤其适用于高表达重组蛋白的菌株。
创新点
['首次在毕赤酵母重组蛋白生产过程中系统鉴定出硫、磷、氮限制的转录标志物基因', '基于PCA分析和转录组热图发现晚期补料阶段的营养限制', '通过补充特定营养盐（硫酸铵或磷酸氢二铵）在转录水平消除营养限制，并显著提高重组蛋白产量', '提出利用qPCR检测标志基因表达作为培养基和过程优化的通用方法']
研究对象（13）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia pastoris (Komagataella phaffii) CBS7435 Mut+ | 磷代谢 | PHO84 | 高亲和力磷酸盐转运蛋白 | 转运 | 磷限制标志基因，晚期上调89倍 |
| Pichia pastoris (Komagataella phaffii) CBS7435 Mut+ | 磷代谢 | PHO5 | 酸性磷酸酶 | 催化 | 磷限制标志基因，晚期约30倍上调 |
| Pichia pastoris (Komagataella phaffii) CBS7435 Mut+ | 磷代谢 | PHO81 | 磷酸盐调控因子 | 调控 | 磷限制标志基因 |
| Pichia pastoris (Komagataella phaffii) CBS7435 Mut+ | 磷代谢 | VTC1 | 液泡多聚磷酸盐合成复合物亚基 | 催化 | 磷限制标志基因，参与液泡多聚磷酸盐合成 |
| Pichia pastoris (Komagataella phaffii) CBS7435 Mut+ | 硫代谢 | JLP1-1 | 磺酸盐/α-酮戊二酸双加氧酶 | 催化 | 硫限制标志基因，晚期上调35倍 |
| Pichia pastoris (Komagataella phaffii) CBS7435 Mut+ | 硫代谢 | SUL1 | 高亲和力硫酸盐通透酶 | 转运 | 硫限制标志基因，硫酸盐摄取 |
| Pichia pastoris (Komagataella phaffii) CBS7435 Mut+ | 硫代谢 | MUP1-1 | 高亲和力甲硫氨酸通透酶 | 转运 | 硫限制标志基因，参与甲硫氨酸和半胱氨酸摄取 |
| Pichia pastoris (Komagataella phaffii) CBS7435 Mut+ | 硫代谢 | MET32 | 转录因子 | 调控 | 硫限制标志基因，调控甲硫氨酸生物合成 |
| Pichia pastoris (Komagataella phaffii) CBS7435 Mut+ | 氮代谢 | DUR3-1 | 尿素转运蛋白 | 转运 | 氮限制相关标志基因 |
| Pichia pastoris (Komagataella phaffii) CBS7435 Mut+ | 氮代谢 | TPO2 | 多胺转运蛋白 | 转运 | 氮限制标志基因，补充氮源后表达下降 |
| Pichia pastoris (Komagataella phaffii) CBS7435 Mut+ | 氮代谢 | PUT1 | 脯氨酸氧化酶 | 催化 | 氮限制标志基因，补充氮源后表达下降 |
| Pichia pastoris (Komagataella phaffii) CBS7435 Mut+ | 氮代谢 | DAL1 | 尿囊素酶 | 催化 | 氮限制标志基因，尿囊素途径 |
| Pichia pastoris (Komagataella phaffii) CBS7435 Mut+ | 重组蛋白生产 | CpB | 猪羧肽酶B | 催化 | 重组产物，由GAP启动子驱动，分泌表达 |
关键发现
- 甲醇和葡萄糖限制性补料分批培养中，晚期磷限制标志基因PHO84转录上调最高达89倍，硫限制标志基因JLP1-1上调达35倍
- 补充(NH4)2SO4使生物量增加5%，CpB活性提高52%
- 补充(NH4)2HPO4使生物量增加9%，CpB活性提高60%
- 对照组最终CpB效价为136 mg/L，(NH4)2SO4补充组达到206 mg/L，(NH4)2HPO4补充组达到217 mg/L
- 磷限制标志基因PHO84的log2FC为4.55（约23倍上调），硫限制相关基因在甲醇培养中特异性上调。
研究结论
转录组分析成功鉴定出毕赤酵母补料分批培养后期存在的硫、磷、氮营养限制；补充相应营养素可在转录水平消除这些限制，并显著提升生物量和重组蛋白产量；鉴定的标志基因可用于培养基和过程优化，尤其适用于高表达菌株。