Deciphering how LIP2 and POX2 promoters can optimally regulate recombinant protein production in the yeast Yarrowia lipolytica
- 作者
- Hosni Sassi, Frank Delvigne, Tambi Kar, Jean-Marc Nicaud, Anne-Marie Crutz-Le Coq, Sebastien Steels, Patrick Fickers
- 单位
- Université libre de Bruxelles; University of Liège-Gembloux AgroBio Tech; Micalis Institute, INRA, AgroParisTech, Université Paris-Saclay
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2017）
- DOI
- 10.1186/s12934-016-0558-8
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
LIP2和POX2启动子驱动重组蛋白生产时需疏水性诱导物（如油酸），成本高且难控制，需阐明碳源对启动子调控的影响以优化诱导策略。
研究策略
将LIP2和POX2启动子与红色荧光蛋白RedStar2融合，在Yarrowia lipolytica中比较不同碳源（葡萄糖、甘油、油酸及其组合）下的启动子诱导强度，并结合流式细胞术、RT-qPCR和代谢参数分析。
核心内容
本研究以解脂耶氏酵母为宿主，将LIP2和POX2启动子与红色荧光蛋白RedStar2融合，系统比较了葡萄糖、甘油、油酸及其组合作为碳源时的启动子诱导强度，并借助流式细胞术、RT-qPCR和代谢参数分析揭示共底物效应。结果发现，pLIP2在含葡萄糖的复合培养基中完全不被诱导而pPOX2仅有微弱表达，表明pLIP2可实现无泄漏的生长阶段。当油酸与葡萄糖按40/60（w/w）混合时，pLIP2的诱导水平比单独油酸提高约10倍，LIP2和RedStar2转录分别增加13.5倍和12.5倍；pLIP2在混合碳源中的荧光强度比单独油酸高57%，pPOX2则提高约21%。此外，混合碳源下油酸比摄取率降低20-30%，且73.8%的细胞呈现低脂质积累表型，说明细胞可同时代谢葡萄糖和油酸。研究表明pLIP2优于pPOX2，采用葡萄糖/油酸40/60比例既能实现生长与诱导分离，又能获得更高重组蛋白产量，为优化解脂耶氏酵母的诱导策略提供了重要依据。
创新点
首次系统研究葡萄糖/甘油作为共底物对LIP2和POX2启动子调控的影响；发现葡萄糖与油酸混合可显著提高pLIP2诱导；利用单细胞分析证明细胞可同时代谢葡萄糖和油酸。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Yarrowia lipolytica | β-氧化 | POX2 | acyl-CoA oxidase 2 | 催化 | 编码酰基辅酶A氧化酶2，参与脂肪酸β-氧化第一步 |
| Yarrowia lipolytica | 脂质代谢 | LIP2 | Lip2p lipase | 催化 | 编码胞外脂肪酶Lip2p |
| Yarrowia lipolytica | 糖酵解 | PGK1 | 3-phosphoglycerate kinase | 催化 | 编码3-磷酸甘油酸激酶 |
| Yarrowia lipolytica | 碳代谢调控 | Hxk1 | hexokinase Hxk1 | 调控 | 参与葡萄糖对LIP2启动子的碳代谢物阻遏 |
| Yarrowia lipolytica | 启动子调控 | RedStar2 | DsRed红色荧光蛋白 | 调控 | 作为报告基因用于量化启动子诱导强度 |
关键发现
- pLIP2在含葡萄糖的复合培养基中完全不被诱导，而pPOX2有微弱诱导
- 在油酸与葡萄糖40/60(w/w)混合时，pLIP2诱导比单独油酸提高10倍（mRNA水平：LIP2和RedStar2转录分别增加13.5倍和12.5倍）
- pLIP2在CMDOA中比CMOA高57%（6482 vs 3926 SFU），pPOX2在CMDOA中比CMOA高约21%（135 vs 172 SFU）
- CMDOA中油酸比摄取率为0.07 g/(gDCW h)，比CMOA的0.10降低20-30%
- 细胞在CMDOA中脂质积累减少（平均荧光840×10^3 FU vs CMOA的900×10^3 FU），且73.8%细胞呈低脂质积累表型。
研究结论
pLIP2是优于pPOX2的启动子，在复合培养基中葡萄糖存在时可实现无泄漏的生长阶段，且以40/60的葡萄糖/油酸比例可获得更高诱导水平，适合驱动重组蛋白生产。