Engineering of glycerol utilization in Gluconobacter oxydans 621H for biocatalyst preparation in a low-cost way
- 作者
- Jinxin Yan, Jing Xu, Menghao Cao, Zhong Li, Chengpeng Xu, Xinyu Wang, Chunyu Yang, Ping Xu, Chao Gao, Cuiqing Ma
- 单位
- State Key Laboratory of Microbial Technology & Shenzhen Research Institute, Shandong University; State Key Laboratory of Microbial Metabolism, Joint International Research Laboratory of Metabolic & Developmental Sciences, and School of Life Sciences & Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University; Dong Ying Oceanic and Fishery Bureau
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2018）
- DOI
- 10.1186/s12934-018-1001-0
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
降低Gluconobacter oxydans全细胞生物催化剂的制备成本，利用生物燃料产业副产物甘油作为廉价碳源替代传统的高浓度山梨醇培养基。
研究策略
阐明G. oxydans 621H的甘油利用机制，敲除与甘油竞争性氧化但非生长必需的膜结合多元醇脱氢酶（GOX0854）和醇脱氢酶（GOX1068），使更多甘油通过甘油利用操纵子进入中心代谢，提高生物量得率；并以木糖氧化为木糖酸验证突变株全细胞催化性能。
核心内容
本研究以氧化葡萄糖酸杆菌621H为对象，开发了以生物柴油副产物甘油为廉价碳源制备全细胞生物催化剂的方法。首先阐明其甘油利用机制，确认甘油-3-磷酸脱氢酶（GOX2088）为生物质合成所必需，同时敲除与甘油竞争性氧化的膜结合多元醇脱氢酶（GOX0854）和醇脱氢酶（GOX1068），使更多甘油进入中心代谢途径。双突变株在10 g/L甘油矿物盐培养基中细胞得率达0.199 g DCW/g甘油，约为野生型的6.9倍，在2 g/L甘油条件下提高2.4倍，且膜结合葡萄糖脱氢酶活性（641.88 mU/mg）与野生型在传统复合培养基中相当。全细胞催化验证显示，双突变株30小时内由58.4 g/L木糖生产61.6 g/L木糖酸，得率1.05 g/g，单位细胞产量7.90 g/g DCW，略优于野生型。该策略有效降低了生物催化剂制备成本，同时保留了膜结合脱氢酶活性，为利用廉价底物进行工业氧化生物转化提供了可行方案。
创新点
首次在矿物盐培养基中以甘油为唯一碳源制备G. oxydans全细胞生物催化剂；通过双基因敲除显著提高细胞得率（2.4倍），同时保留膜结合葡萄糖脱氢酶活性，实现低成本生物转化。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Gluconobacter oxydans 621H | 甘油氧化途径 | gox0854 (sldA) | 多元醇脱氢酶（甘油脱氢酶） | 催化 | 催化甘油氧化为DHA；敲除后DHA产量为零 |
| Gluconobacter oxydans 621H | 甘油氧化途径 | gox1068 (adhB) | 膜结合醇脱氢酶（亚基） | 催化 | 催化甘油氧化为甘油醛进而生成甘油酸；与GOX1067构成复合物 |
| Gluconobacter oxydans 621H | 甘油利用/中心代谢 | gox2088 (glpD) | 甘油-3-磷酸脱氢酶 | 催化 | 催化G3P氧化为DHAP；敲除后菌株不能以甘油为唯一碳源生长 |
| Gluconobacter oxydans 621H | 甘油利用 | gox2089 (glpF) | 甘油摄取促进蛋白 | 转运 | 介导甘油跨膜转运进入细胞 |
| Gluconobacter oxydans 621H | 甘油利用 | gox2090 (glpK) | 甘油激酶 | 催化 | 催化甘油磷酸化生成甘油-3-磷酸 |
| Gluconobacter oxydans 621H | 甘油利用 | gox2087 (glpR) | 甘油-3-磷酸操纵子阻遏蛋白 | 调控 | 转录调控甘油利用操纵子的表达 |
| Gluconobacter oxydans 621H | 木糖氧化途径 | gox0265 | 膜结合葡萄糖脱氢酶 | 催化 | 催化木糖氧化为木糖酸，是全细胞生物转化木糖的关键酶 |
关键发现
- G. oxydans 621H在含10 g/L甘油的矿物盐培养基中24 h ΔOD600为0.63，消耗甘油10.8 g/L，生成DHA 9.26 g/L（产率0.86 g/g）。敲除GOX2088后菌株不能以甘油为唯一碳源生长，证明甘油利用操纵子是生物质合成所必需
- 敲除GOX1068和GOX0854后，双突变株在10 g/L甘油中细胞得率为0.199 g DCW/g甘油，是野生型(0.029 g DCW/g)的约6.9倍
- 在2 g/L甘油条件下，双突变株细胞得率是野生型(0.067 g DCW/g)的2.4倍。全细胞生物转化中，双突变株在30 h内由58.4 g/L木糖生产61.6 g/L木糖酸，得率1.05 g/g，单位细胞产量7.90 g木糖酸/g DCW
- 野生型相应为57.4 g/L、0.99 g/g、7.36 g/g。双突变株在矿物盐甘油培养基中的葡萄糖脱氢酶活性为641.88 mU/mg，木糖脱氢酶活性为79.81 mU/mg，与野生型在传统复合培养基中的活性相近。
研究结论
本研究开发了一种利用生物燃料副产物甘油低成本制备G. oxydans全细胞生物催化剂的方法。通过敲除GOX1068和GOX0854，构建了能以高得率利用甘油合成生物量并保留膜结合葡萄糖脱氢酶活性的突变株，其全细胞可用于木糖到木糖酸等氧化生物转化，具有工业应用潜力。