High-titer production of 13R-manoyl oxide in metabolically engineered Saccharomyces cerevisiae
- 作者
- Chuanbo Zhang, Haiyan Ju, Chun-Zhe Lu, Fanglong Zhao, Jingjing Liu, Xiaoyan Guo, Yufen Wu, Guang-Rong Zhao, Wenyu Lu
- 单位
- School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University; Key Laboratory of System Bioengineering (Tianjin University), Ministry of Education; SynBio Research Platform, Collaborative Innovation Center of Chemical Science and Engineering (Tianjin)
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2019）
- DOI
- 10.1186/s12934-019-1123-z
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
二萜类化合物在植物中含量低、结构复杂，难以通过化学合成或植物提取实现商业化生产，需要构建高效的微生物细胞工厂。
研究策略
在酿酒酵母中异源表达来自鞘蕊花（Coleus forskohlii）的13R-MO合成酶基因CfTPS2和CfTPS3，通过逐步代谢工程改造：过表达MVA途径限速酶tHMG1和ERG20，在转录和蛋白水平调控ERG9，融合Bts1p与Erg20F96Cp，截短二萜合酶的叶绿体转运肽，并优化发酵条件实现高产量。
核心内容
该研究在酿酒酵母中构建了高效从头合成二萜类化合物13R-甘露醇氧化物（13R-MO）的细胞工厂。通过在酵母中异源表达来自鞘蕊花的13R-MO合成酶基因CfTPS2和CfTPS3，并采用多种代谢工程策略进行逐步优化：过表达甲羟戊酸途径限速酶tHMG1和ERG20，在转录和蛋白水平双重调控ERG9基因（启动子替换与PEST标签），融合Bts1p与Erg20F96Cp以偶联FPP与GGPP合成，以及截短二萜合酶的叶绿体转运肽提高酶活性。初始菌株仅产2.31 mg/L，经系列改造后最终菌株LZJ7摇瓶产量达328.15 mg/L，较原始菌株提高142倍。在5 L发酵罐补料分批发酵中产量达到3001.46 mg/L（约3 g/L），为目前报道的最高水平。该研究通过组合代谢工程策略成功实现了13R-MO的高效微生物生产，为其他高价值二萜类化合物的绿色制造提供了可行策略。
创新点
1) 首次在酵母中实现13R-MO的高效从头合成，最终产量达3 g/L，为目前报道最高；2) 结合启动子替换和PEST标签在转录和蛋白水平双重调控ERG9；3) 采用Bts1-GGGS-Erg20F96C融合蛋白有效偶联FPP与GGPP合成；4) 通过截短N端叶绿体转运肽显著提高二萜合酶活性。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸（MVA）途径 | tHMG1 | 截短HMG-CoA还原酶 | 催化 | 过表达以增强MVA途径通量 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸（MVA）途径 | ERG20 | 法尼基焦磷酸合酶 | 催化 | 过表达以增加FPP供应 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸（MVA）途径 | ERG20F96C | 突变型法尼基焦磷酸合酶（F96C突变） | 催化 | 突变体可直接产生GGPP |
| Saccharomyces cerevisiae | 二萜生物合成 | BTS1 | 香叶基香叶基焦磷酸合酶 | 催化 | 催化FPP与IPP缩合生成GGPP |
| Saccharomyces cerevisiae | 二萜生物合成 | BTS1-ERG20F96C (融合) | Bts1-GGGS-Erg20F96C融合蛋白 | 催化 | 融合蛋白偶联FPP和GGPP合成 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甾醇合成 | ERG9 | 角鲨烯合酶 | 催化 | 通过MET3p启动子替换和PEST标签下调表达，减少副产物角鲨烯 |
| Saccharomyces cerevisiae | 二萜生物合成 | CfTPS2 | 柯巴基二磷酸合酶（copal-8-ol diphosphate合酶） | 催化 | 催化GGPP生成copal-8-ol diphosphate |
| Saccharomyces cerevisiae | 二萜生物合成 | CfTPS3 | 13R-甘露醇氧化物合酶 | 催化 | 催化copal-8-ol diphosphate生成13R-MO |
| Saccharomyces cerevisiae | 二萜生物合成 | tCfTPS2 | 截短柯巴基二磷酸合酶（去除叶绿体转运肽） | 催化 | 截短后提高在酵母中的催化活性 |
| Saccharomyces cerevisiae | 二萜生物合成 | tCfTPS3 | 截短13R-甘露醇氧化物合酶 | 催化 | 截短后提高在酵母中的催化活性 |
关键发现
- 初始菌株GW-1仅产2.31 mg/L 13R-MO
- 经逐步改造后，LZJ2（ERG9-PEST）产3.52 mg/L，LZJ3（共表达BTS1和ERG20F96C）产7.78 mg/L，LZJ5（Bts1-GGGS-Erg20F96C融合）产23.31 mg/L，LZJ6（截短CfTPS2/3）产176.8 mg/L，最终菌株LZJ7产328.15 mg/L，较原始菌株提高142倍。在5 L发酵罐中，分批发酵产量达602.05 mg/L，补料分批发酵产量达3001.46 mg/L（约3 g/L）。此外，通过优化葡萄糖浓度，摇瓶最高产量为469.26 mg/L（40 g/L葡萄糖）。副产物方面，LZJ5中GGOH积累达93.12 mg/L，LZJ7中降至17.32 mg/L。
研究结论
本研究通过组合代谢工程策略成功构建了高效生产13R-MO的酿酒酵母细胞工厂，实现了从葡萄糖到3 g/L 13R-MO的从头合成，为其他高价值二萜类化合物的微生物生产提供了可行策略。