Heterologous expression of cytotoxic sesquiterpenoids from the medicinal mushroom Lignosus rhinocerotis in yeast
- 作者
- Hui-Yeng Yeannie Yap, Mariano Jordi Muria-Gonzalez, Boon-Hong Kong, Keith A. Stubbs, Chon-Seng Tan, Szu-Ting Ng, Nget-Hong Tan, Peter S. Solomon, Shin-Yee Fung, Yit-Heng Chooi
- 单位
- Department of Molecular Medicine, Faculty of Medicine, University of Malaya; Research School of Biology, The Australian National University; School of Molecular Sciences, University of Western Australia; Ligno Biotech; Centre for Crop and Disease Management, Curtin University
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2017）
- DOI
- 10.1186/s12934-017-0713-x
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
从药用蘑菇虎奶菇（Lignosus rhinocerotis）中挖掘和鉴定具有细胞毒活性的倍半萜化合物，并解析其生物合成基因。
研究策略
利用转录组数据指导，从L. rhinocerotis基因组中克隆三个在菌核中高表达的倍半萜合酶基因（GME3634、GME3638、GME9210），在酿酒酵母BJ5464中异源表达，通过GC-MS和NMR鉴定产物，并测试纯化化合物的抗癌活性。
核心内容
该研究以药用蘑菇虎奶菇为对象，利用转录组数据指导，从其基因组中克隆了三个在菌核中高表达的倍半萜合酶基因，并在酿酒酵母BJ5464中异源表达。通过GC-MS和NMR鉴定产物结构，并测试了纯化化合物的抗癌活性。结果显示，三个基因均成功表达：GME3638产生19种倍半萜，主要产物为(+)-torreyol；GME3634产生8种倍半萜，主要产物为α-cadinol；GME9210仅产生两种低丰度倍半萜。从6升培养物中纯化得到(+)-torreyol 5.1毫克和α-cadinol 1.0毫克。活性测试表明，(+)-torreyol对MCF7乳腺癌细胞的IC50为3.5 μg/ml，对正常乳腺上皮细胞的IC50为22.7 μg/ml，表现出选择性细胞毒活性，而α-cadinol对MCF7的IC50为18.0 μg/ml。这是首次从多孔菌科真菌中表征倍半萜合酶，鉴定了(+)-torreyol和α-cadinol的生物合成基因，并证明其编码蛋白属于Clade I。该工作表明转录组学指导下的酵母异源表达系统是挖掘药用真菌活性次级代谢产物的有效方法，(+)-torreyol具有潜在抗癌药物开发价值。
创新点
首次从多孔菌科真菌中表征倍半萜合酶；鉴定了(+)-torreyol和α-cadinol的生物合成基因；发现(+)-torreyol对MCF7乳腺癌细胞具有选择性细胞毒活性。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae BJ5464 | 倍半萜生物合成（甲羟戊酸途径提供FPP） | GME3634 | 倍半萜合酶（sesquiterpene synthase） | 催化 | 主要产物为α-cadinol，次要产物包括germacrene D-4-ol等；与GME3638共享57.2%蛋白序列一致性。 |
| Saccharomyces cerevisiae BJ5464 | 倍半萜生物合成（甲羟戊酸途径提供FPP） | GME3638 | 倍半萜合酶（sesquiterpene synthase） | 催化 | 主要产物为(+)-torreyol，次要产物包括germacrene D-4-ol等；产生最多样化的倍半萜（19种）。 |
| Saccharomyces cerevisiae BJ5464 | 倍半萜生物合成（甲羟戊酸途径提供FPP） | GME9210 | 倍半萜合酶（sesquiterpene synthase） | 催化 | 产量较低，仅产生两种倍半萜，其中一种为1,3,4,5,6,7-六氢-2,5,5-三甲基-2H-2,4a-乙桥萘，未获得足量进行NMR分析。 |
关键发现
- 三个倍半萜合酶基因在酵母中成功表达：GME3638产生19种倍半萜（其中6种醇），主要产物为(+)-torreyol（保留时间12.1 min）；GME3634产生8种倍半萜（其中5种醇），主要产物为α-cadinol（保留时间12.18 min）；GME9210仅产生2种低丰度倍半萜。从6 L培养物中纯化得到(+)-torreyol
- 1±0.50 mg，α-cadinol
- 0±0.25 mg。(+)-torreyol对MCF7细胞的IC50为3.5±0.58 μg/ml，α-cadinol为18.0±3.27 μg/ml；(+) -torreyol对A549、PC-3和正常乳腺上皮184B5细胞的IC50分别为6.5±3.28、12.5±1.50和22.7±1.15 μg/ml。GME3634和GME3638蛋白一致性为57.2%，系统发育分析显示它们属于Clade I，且与多孔菌科其他物种中的同源基因配对存在。
研究结论
基于转录组学指导的酵母异源表达系统是挖掘药用真菌生物活性次级代谢产物的有效方法；(+)-torreyol是MCF7细胞的选择性细胞毒剂，具有潜在的抗癌药物开发价值。