Efficient yeast surface-display of novel complex synthetic cellulosomes
- 作者
- Hongting Tang, Jiajing Wang, Shenghuan Wang, Yu Shen, Dina Petranovic, Jin Hou, Xiaoming Bao
- 单位
- State Key Laboratory of Microbial Technology, Shandong University; Shandong Provincial Key Laboratory of Microbial Engineering, Qi Lu University of Technology; Department of Biology and Biological Engineering, Chalmers University of Technology
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2018）
- DOI
- 10.1186/s12934-018-0971-2
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
酵母表面展示纤维小体在整合生物加工中面临支架蛋白展示水平低、纤维素酶自组装效率低、纤维素酶活性不足等问题，限制了纤维素直接转化为乙醇的效率。
研究策略
利用酿酒酵母内源a-凝集素亚基Aga1p（重复N端片段tAga1）与Aga2p之间的二硫键相互作用，作为新型cohesin-dockerin蛋白对，构建合成支架蛋白ScafAGA3/ScafAGA5并与传统支架蛋白ScafCipA3组合成双支架复合纤维小体，同时通过连接肽优化和分泌途径工程提高纤维素酶活性，实现纤维素直接发酵产乙醇。
核心内容
本研究利用酿酒酵母内源α-凝集素系统中Aga1p（tAga1重复片段）与Aga2p之间的二硫键相互作用，构建了新型cohesin-dockerin替代蛋白对，用于酵母表面展示合成纤维小体。研究设计了含三个或五个tAga1重复的支架蛋白ScafAGA3/ScafAGA5，并与传统CipA3支架组合成双支架复合体系，同时结合连接肽优化和分泌途径工程提升纤维素酶活性。结果显示，ScafAGA3展示阳性细胞比例为54.6%，较ScafCipA3的38.6%提高41.3%；二硫键组装效率显著高于cohesin-dockerin系统，例如Te-aCBH1组装效率达6.39%，而Te-dCBH1仅为1.80%。含ScafAGA3的菌株从磷酸膨胀纤维素产乙醇0.89 g/L，为ScafCipA3组装菌株的3倍；优化后双支架体系进一步将乙醇产量提升至1.52 g/L。此外，过表达SNC2p使PYD1-L-dCBH1胞外活性提高45.1%。该研究首次实现基于二硫键的复杂多组分纤维小体组装，显著提高了支架展示效率和酶组装效率，为酵母协同降解纤维素并生产乙醇提供了新策略。
创新点
首次通过二硫键构建复杂多组分纤维小体组装系统；利用酵母内源Aga1p-Aga2p蛋白对替代细菌cohesin-dockerin，显著提高支架展示效率和酶组装效率；设计双支架系统（ScafAGA和ScafCipA3）实现复杂纤维小体自组装；结合连接肽优化和分泌途径工程提高纤维素酶分泌和活性。
研究对象（12）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK102-5B | 纤维素降解与乙醇发酵 | AGA1 | Aga1p（tAga1p片段） | 区室化 | 细胞壁锚定蛋白，通过二硫键与Aga2p结合，作为合成支架的重复单元 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK102-5B | 纤维素降解与乙醇发酵 | AGA2 | Aga2p | 区室化 | 与tAga1p形成二硫键，作为dockerin单元融合纤维素酶或支架蛋白 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK102-5B | 纤维素降解与乙醇发酵 | 人工合成scaffoldin基因 | ScafAGA3（含三个tAga1重复和CBD） | 区室化 | 新型锚定支架蛋白，展示效率高于传统ScafCipA3 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK102-5B | 纤维素降解与乙醇发酵 | 人工合成scaffoldin基因 | ScafAGA5（含五个tAga1重复和CBD） | 区室化 | 增加tAga1重复数，展示阳性率55.6% |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK102-5B | 纤维素降解与乙醇发酵 | cipA（来自Clostridium thermocellum） | ScafCipA3 | 区室化 | 传统支架蛋白，含三个cohesin和CBD，与dockerin非共价结合 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK102-5B | 纤维素降解与乙醇发酵 | SED1 | Sed1p | 区室化 | 用于验证tAga1p功能的锚定蛋白 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK102-5B | 纤维素降解与乙醇发酵 | bgl1（来自Saccharomyces fibuligera） | Sf-BGL1 | 催化 | β-葡萄糖苷酶，融合Aga2p或dockerin用于组装 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK102-5B | 纤维素降解与乙醇发酵 | cbh1（来自Talaromyces emersonii） | Te-CBH1 | 催化 | 外切葡聚糖酶，活性为三种外切酶中最高 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK102-5B | 纤维素降解与乙醇发酵 | celA（来自Clostridium thermocellum） | Ct-CelA | 催化 | 内切葡聚糖酶，活性为三种内切酶中最高 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK102-5B | 分泌途径 | PDI1 | Pdi1p | 调控 | 二硫键异构酶，过表达提高Ct-CelA活性17% |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK102-5B | 分泌途径 | SSO1 | Sso1p | 转运 | t-SNARE蛋白，过表达提高Tr-L-dBGL1活性19.8% |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK102-5B | 分泌途径 | SNC2 | Snc2p | 转运 | v-SNARE蛋白，过表达提高PYD1-L-dCBH1活性45.1% |
关键发现
- ScafAGA3展示阳性细胞比例为54.6%，较ScafCipA3的38.6%提高41.3%；ScafAGA5展示阳性比例为55.6%；通过二硫键组装效率显著高于cohesin-dockerin：Te-aCBH1
- 39% vs Te-dCBH1
- 80%，Ct-aCelA
- 88% vs Ct-dCelA
- 58%，Sf-aBGL1
- 90% vs Sf-dBGL1
- 58%；含ScafAGA3组装菌株从PASC产乙醇0.89 g/L，为ScafCipA3组装菌株的3倍；优化后双支架复合纤维小体（ScafAGA5+ScafCipA3）产乙醇0.87 g/L，较未优化提高73%；调整酶比例后乙醇产量达1.52 g/L；来自T. reesei CBH1和C. cellulovorans EngB的连接肽使Sf-dBGL1活性分别提高2.2和2.4倍，合成连接肽使Te-dCBH1活性提高2.1倍；过表达Sso1p使Tr-L-dBGL1胞外活性提高19.8%，过表达SNC2p使PYD1-L-dCBH1胞外活性提高45.1%。
研究结论
本研究首次开发了基于二硫键的复杂多组分组装系统，应用于合成纤维小体构建，显著提高了支架展示效率和纤维素酶组装效率，为酵母表达协同酶系和纤维乙醇生产提供了新策略。