Mevalonate production from ethanol by direct conversion through acetyl-CoA using recombinant Pseudomonas putida, a novel biocatalyst for terpenoid production
- 作者
- Jeongmo Yang, Ji Hee Son, Hyeonsoo Kim, Sukhyeong Cho, Jeong-geol Na, Young Joo Yeon, Jinwon Lee
- 单位
- Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Sogang University; C1 Gas Refinery R&D Center, Sogang University; Department of Biochemical Engineering, Gangneung-Wonju National University
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2019）
- DOI
- 10.1186/s12934-019-1213-y
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何利用乙醇作为碳源，通过恶臭假单胞菌高效生产甲羟戊酸（萜类合成的重要前体），并克服异源表达不稳定、乙酸积累和碳流分配等问题。
研究策略
在Pseudomonas putida KT2440中异源表达甲羟戊酸上游途径关键基因（atoB、mvaS、mvaE），通过删除内切酶基因（endA、endX）提高遗传稳定性，删除qedH基因减缓乙醇氧化速率以避免乙酸积累，并尝试减少脂肪酸合成通量（如表达nphT7、敲除phaG），最后通过pH优化分批发酵提高产率。
核心内容
本研究在恶臭假单胞菌KT2440中异源表达甲羟戊酸途径关键基因atoB、mvaS和mvaE，首次实现以乙醇为唯一碳源直接生物合成甲羟戊酸。利用乙醇转化为乙酰-CoA时无碳损失且不产生丙酮酸衍生副产物的优势，研究者通过敲除内切酶基因endA和endX增强异源质粒稳定性，使荧光信号提高1.40倍、标准偏差降低3.74倍；并通过删除醌蛋白乙醇脱氢酶基因qedH减缓乙醇氧化速率，彻底避免乙酸积累。最终工程菌ELPP211在200 mM乙醇条件下可生产4.07 g/L甲羟戊酸，较初始菌株2.39倍提升；摇瓶培养最高产率达0.41 g/g乙醇，1 L分批发酵（pH 6.75）从14.3 g/L乙醇获得4.60 g/L甲羟戊酸，产率为0.32 g/g乙醇。而削弱脂肪酸合成通量（表达nphT7或敲除phaG）对增产无显著效果，表明工程化甲羟戊酸途径已有效竞争乙酰-CoA。该工作确立了恶臭假单胞菌作为以乙醇为底物生产萜类前体甲羟戊酸的高效新型生物催化剂平台。
创新点
['首次在恶臭假单胞菌中实现从乙醇到甲羟戊酸的直接生物转化，利用乙醇转化为乙酰-CoA时无碳损失且不产生丙酮酸衍生副产物的优点。', '通过敲除内切酶基因改善异源质粒稳定性，显著提高甲羟戊酸产量与重复性。', '删除qedH基因调节乙醇代谢速率，有效防止乙酸积累导致的发酵失败。', '在摇瓶和分批发酵中分别获得0.41 g/g和0.32 g/g的甲羟戊酸/乙醇产率，为当时非糖类碳源最高实验产率。']
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pseudomonas putida KT2440及其衍生菌株 | 甲羟戊酸生物合成途径 | atoB | 乙酰辅酶A乙酰转移酶 | 催化 | 来自Escherichia coli，在ELPP010及后续菌株中表达，催化乙酰-CoA生成乙酰乙酰-CoA。 |
| Pseudomonas putida KT2440及其衍生菌株 | 甲羟戊酸生物合成途径 | mvaS | 羟甲基戊二酰辅酶A合酶 | 催化 | 来自Enterococcus faecalis，在ELPP010及后续菌株中表达，催化乙酰乙酰-CoA与乙酰-CoA缩合生成HMG-CoA。 |
| Pseudomonas putida KT2440及其衍生菌株 | 甲羟戊酸生物合成途径 | mvaE | 乙酰辅酶A乙酰转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶（双功能酶） | 催化 | 来自Enterococcus faecalis，在ELPP010及后续菌株中表达，兼具催化乙酰-CoA硫解和HMG-CoA还原为甲羟戊酸的功能。 |
| Pseudomonas putida KT2440及其衍生菌株 | 乙醇代谢途径（乙醇→乙酰-CoA） | acs | 乙酰辅酶A合成酶 | 催化 | 来自Escherichia coli MG1655，在ELPP111及其后续菌株中表达，将乙酸转化为乙酰-CoA。 |
| Pseudomonas putida KT2440及其衍生菌株 | 乙醇代谢途径（乙醛→乙酰-CoA） | eutE | 乙醛脱氢酶/乙醇胺利用蛋白 | 催化 | 来自Escherichia coli，在ELPP212和ELPP213中表达，尝试将乙醛直接转化为乙酰-CoA，但实际效果负面。 |
| Pseudomonas putida KT2440及其衍生菌株 | 脂肪酸/甲羟戊酸途径（乙酰-CoA与丙二酰-CoA缩合） | nphT7 | 乙酰辅酶A:丙二酰辅酶A酰基转移酶 | 催化 | 来自Streptomyces sp. CL190，在ELPP221中表达，旨在促进丙二酰-CoA进入甲羟戊酸途径，但导致严重生长抑制。 |
| Pseudomonas putida KT2440及其衍生菌株 | 乙醇代谢途径（周质空间乙醇氧化） | qedH（qedH-I和qedH-II） | 醌蛋白乙醇脱氢酶 | 催化 | 内源基因，在ELPP211等菌株中被敲除以减缓乙醇氧化速率，防止乙酸快速积累。 |
| Pseudomonas putida KT2440及其衍生菌株 | 脂肪酸/聚羟基脂肪酸酯（PHA）生物合成 | phaG | (R)-3-羟基癸酰-ACP:CoA转酰基酶 | 催化 | 内源基因，在ELPP311中被敲除以阻断PHA合成，但对甲羟戊酸产量无显著影响。 |
| Pseudomonas putida KT2440及其衍生菌株 | DNA修复/外源DNA降解 | endA | 内切核酸酶I | 调控 | 内源基因，被敲除以提高异源质粒的遗传稳定性，增加外源基因表达。 |
| Pseudomonas putida KT2440及其衍生菌株 | DNA修复/外源DNA降解 | endX | 胞外DNA内切核酸酶 | 调控 | 内源基因，被敲除以提高异源质粒的遗传稳定性。 |
关键发现
- ['在200 mM乙醇条件下，初始重组菌ELPP010可生产1.70 g/L甲羟戊酸；通过遗传稳定性改良和乙醇代谢操纵（ELPP211），产量提高至4.07 g/L，提升2.39倍（1.70 vs
- 07 g/L）。', '敲除endA和endX后，异源质粒稳定性增加，荧光信号相对提高1.27倍（ELPP0dT0）和1.40倍（ELPP1dT0），标准偏差降低3.74倍（ELPP1dT0在48 h）。', '删除qedH-I和qedH-II后，ELPP211在27 h内未检测到乙酸积累，甲羟戊酸产量达4.07 ±
- 29 g/L，重复性显著改善。', '摇瓶培养中最高产率为0.41 g甲羟戊酸/g乙醇，在1 L分批发酵中（pH
- 75）从14.3 g/L乙醇（约300 mM）生产4.60 g/L甲羟戊酸，产率0.32 g/g乙醇。', 'pH
- 75为最优条件，避免乙酸积累同时保持较高产量；pH
- 5时因乙酸积累导致产量显著下降。', '表达nphT7引起严重细胞生长抑制，而敲除phaG对甲羟戊酸产量无显著影响，说明工程化甲羟戊酸途径已有效分流乙酰-CoA，避免PHA积累。']
研究结论
本研究成功开发了恶臭假单胞菌作为将乙醇高效转化为甲羟戊酸的新型生物催化剂，通过组合基因操作（增强遗传稳定性、优化乙醇代谢、弱化副产物途径）和pH控制，达到了以非糖碳源为底物的最高甲羟戊酸产率，为萜类化合物的微生物生产开辟了新途径。