Metabolic perturbations in mutants of glucose transporters and their applications in metabolite production in Escherichia coli
- 作者
- Hwi-Min Jung, Dae-Kyun Im, Jae Hyung Lim, Gyoo Yeol Jung, Min-Kyu Oh
- 单位
- 高丽大学化学与生物工程系; 浦项科技大学化学工程系; 浦项科技大学跨学科生物科学与生物工程系
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2019）
- DOI
- 10.1186/s12934-019-1224-8
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
快速生长的大肠杆菌在富葡萄糖有氧条件下产生乙酸溢出，导致发酵液酸化、生长抑制和产物产率下降。需要找到一种策略来缓解溢出代谢并提高产物比产率。
研究策略
通过敲除主要葡萄糖转运蛋白（ptsG、mglB、malE、galP）构建糖摄取受损的突变株，结合转录组分析和13C代谢通量分析解析代谢重排，并将EGFP、GABA、番茄红素等产物合成途径导入突变株，评估比产率改善。
核心内容
该研究通过敲除大肠杆菌主要葡萄糖转运蛋白（ptsG、mglB、malE、galP）构建糖摄取受损的突变株，旨在缓解富葡萄糖有氧条件下的乙酸溢出代谢并提高产物比产率。与野生型相比，敲除ptsG的ST2和敲除四种转运蛋白的ST8最大OD600分别提高56%和77%，比生长速率从0.87/h降至0.34/h和0.33/h，葡萄糖摄取率分别降低41%和69%，乙酸产量从3.2 g/L降至0.24 g/L和0.57 g/L，生物量产率提高24%和77%。转录组分析显示1317个基因（28%）表达变化，糖酵解基因下调、糖异生和TCA循环基因上调；13C代谢通量分析揭示Pgi通量从72.8%降至52.0%，乙醛酸支路通量升至16.2%，氧化磷酸化ATP生成比例提高16.7%。将EGFP、GABA和番茄红素合成途径导入突变株后，EGFP荧光强度提高282%、比产率提高132%，GABA终产量提高130%、比产率提高176%，番茄红素终产量提高132%、比产率提高90%，且番茄红素生产菌株不产生乙酸。该策略表明通过下调糖摄取速率而非筛选快速生长菌株，可系统性重定向碳流、增强能量效率和碳源回收，为改善多种代谢产物的生产提供了有效底盘平台。
创新点
['系统揭示了糖转运蛋白缺失引起的全局转录组和代谢通量变化', '发现糖转运突变株能同时提高生物量产量和多种产物的比产率', '提出通过下调糖摄取速率而非传统筛选快速生长菌株来优化代谢产物生产的策略']
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli W (KCTC1039) | 葡萄糖转运/磷酸转移酶系统(PTS) | ptsG | PtsG (EIICB) | 转运 | 主要葡萄糖PTS转运蛋白，敲除后降低葡萄糖摄取速率 |
| Escherichia coli W (KCTC1039) | 葡萄糖转运 | mglB, malE, galP | MglB, MalE, GalP | 转运 | 非特异性糖转运蛋白，与ptsG共同敲除构建ST8株 |
| Escherichia coli W (KCTC1039) | GABA合成 | gadB | GadBmut (Glu89Gln/Δ452-466) | 催化 | 来源于谷氨酸棒状杆菌的谷氨酸脱羧酶突变体，催化谷氨酸转化为GABA |
| Escherichia coli W (KCTC1039) | GABA合成 | gadC | GadCmut (1-470) | 转运 | 来源于谷氨酸棒状杆菌的GABA/谷氨酸反向转运蛋白突变体 |
| Escherichia coli W (KCTC1039) | 谷氨酸合成 | gltB, gltD | GltB, GltD | 催化 | 谷氨酸合酶，用于GABA前体谷氨酸的合成 |
| Escherichia coli W (KCTC1039) | 甲基赤藓醇磷酸(MEP)途径 | dxs, idi, ispA, crtE, crtB, crtI | DXS, IDI, IspA, CrtE, CrtB, CrtI | 催化 | 番茄红素合成途径相关酶，dxs和idi/ispA增强前体供给，crtEBI合成番茄红素 |
| Escherichia coli W (KCTC1039) | 全局碳代谢调控 | cra, crp | Cra, CRP | 调控 | 转录因子，在糖转运突变体中介导全局基因表达变化（如糖酵解下调、TCAC上调） |
关键发现
- 与野生型ST1相比，ST2（ΔptsG）和ST8（ΔptsG ΔmglB ΔmalE ΔgalP）的最大OD600分别提高56%和77%，比生长速率从0.87/h降至0.34/h和0.33/h（降低61%），葡萄糖摄取率分别降低41%和69%，乙酸产量从3.2 g/L降至0.24 g/L和0.57 g/L，生物量产率提高24%和77%。转录组分析显示28%的基因（1317个）表达变化
- 糖酵解基因下调，糖异生和TCA循环基因上调，趋化性和鞭毛合成基因下调，应激相关蛋白基因上调。13C MFA显示Pgi通量从72.8%降至52.0%，乙醛酸支路通量从1.5%升至8.0%和16.2%，氧化磷酸化ATP生成比例提高15.5%和16.7%，乙酰辅酶A合成酶通量从56%变为-5.1%和-4.7%。在产物生产中，EGFP荧光强度在STE2和STE8中分别提高160%和282%，比产率提高35%和132%
- GABA终产量在STG2和STG8中提高119%和130%，比产率提高61%和176%
- 番茄红素终产量在STL2和STL8中提高96%和132%，比产率提高35%和90%，且STL2和STL8不产生乙酸。
研究结论
敲除葡萄糖转运蛋白导致全局基因表达改变和碳流重定向，增强能量效率和碳源回收。糖转运突变株作为底盘可显著提高EGFP、GABA和番茄红素的比产率，表明控制糖摄取速率是改善代谢产物生产的有效策略。