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Identification of sesquiterpene synthases from the Basidiomycota Coniophora puteana for the efficient and highly selective β-copaene and cubebol production in E. coli

作者
Wolfgang Mischko, Max Hirte, Monika Fuchs, Norbert Mehlmer, Thomas B. Bruck
杂志
Microbial Cell Factories（2018）
DOI
10.1186/s12934-018-1010-z
所属领域
代谢工程
关键词
BasidiomycotaConiophora puteanaCopaeneCubebolFermentationHeterologous expressionPhylogenetic analysisSesquiterpene
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解决的核心问题

从木材腐朽真菌Coniophora puteana中鉴定倍半萜合酶，实现β-copaene和cubebol的高效、高选择性微生物生产。

研究策略

基于基因组挖掘，从C. puteana中克隆三个推定萜烯合酶基因，在E. coli中异源表达，并通过共表达MEP途径瓶颈酶(DXS、Idi)增强前体FPP供应，结合补料分批发酵优化产物产量。

研究路线图

100%
研究问题：
鉴定高选择性倍半萜合酶
策略：
基因组挖掘+异源表达
关键改造：
共表达MEP瓶颈酶(DXS,Idi)
关键改造：
克隆Copu2/Copu3合酶
结果：
β-copaene产量215mg/L
结果：
cubebol产量497mg/L
结果：
选择性62%/75%
结果：
cubebol产量提高50倍
结论：
实现高选择性工业化生产
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核心内容

本研究通过对木材腐朽真菌Coniophora puteana进行基因组挖掘，克隆并异源表达了三个推定萜烯合酶基因，在E. coli HMS174(DE3)中成功鉴定出两个高选择性倍半萜合酶：Copu2（β-copaene合酶，选择性62%）和Copu3（cubebol合酶，选择性75%）。通过共表达MEP途径瓶颈酶DXS和Idi增强前体FPP供应，并结合补料分批发酵优化，β-copaene产量达215 mg/L，cubebol产量达497 mg/L，特定产量分别为4.4 mg/g DCW和7.2 mg/g DCW，生产力分别为4.7 mg/L/h和11.2 mg/L/h。其中cubebol产量较此前植物来源合酶报道的10 mg/L提高约50倍，首次实现了β-copaene的技术规模生产。该研究提供了两个高选择性倍半萜合酶资源，构建的E. coli全细胞工厂在产物选择性和产量上均超越现有报道，为β-copaene和cubebol的工业化生物制造奠定了基础。

创新点

首次报道了高选择性的β-copaene合酶(Copu2，选择性62%)和cubebol合酶(Copu3，选择性75%)；获得的cubebol产量比现有生物技术方法提高50倍；首次实现β-copaene的技术规模生产。

研究对象（6）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Escherichia coli HMS174 (DE3) 非甲羟戊酸途径(MEP) dxs 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase 催化 共表达增强前体供应
Escherichia coli HMS174 (DE3) 非甲羟戊酸途径(MEP) idi isopentenyl pyrophosphate:dimethylallyl pyrophosphate isomerase 催化 来自Haematococcus lacustris，共表达
Escherichia coli HMS174 (DE3) 倍半萜生物合成 Copu1 推测的萜烯合酶 催化 未检测到产物，推测无功能
Escherichia coli HMS174 (DE3) 倍半萜生物合成 Copu2 β-copaene synthase 催化 产物β-copaene选择性62%
Escherichia coli HMS174 (DE3) 倍半萜生物合成 Copu3 cubebol synthase 催化 产物cubebol选择性75%
Escherichia coli HMS174 (DE3) 二萜生物合成 crtE geranylgeranyl diphosphate synthase 催化 来自Pantoea ananatis，用于研究二萜合成

关键发现

  1. 鉴定到Copu2和Copu3两个倍半萜合酶，分别选择性生成β-copaene(62%选择性)和cubebol(75%选择性)
  2. 在优化的E. coli生产系统中，β-copaene产量达215 mg/L，cubebol产量达497 mg/L，特定产量分别为4.4 mg/g DCW和7.2 mg/g DCW，生产力分别为4.7 mg/L/h和11.2 mg/L/h
  3. cubebol产量比报道的植物来源合酶产量(10 mg/L)高50倍
  4. β-copaene在氯仿中可重排为α-copaene。

研究结论

本研究从C. puteana中鉴定了两个高选择性倍半萜合酶Copu2和Copu3，并构建了E. coli全细胞工厂，实现了β-copaene和cubebol的高水平生产，产物选择性和产量均超过现有报道，为工业化生产提供了新途径。