Metabolic engineering of Escherichia coli BL21 strain using simplified CRISPR-Cas9 and asymmetric homology arms recombineering

作者: Sudha Shukal, Xiao Hui Lim, Congqiang Zhang, Xixian Chen
单位: 新加坡科技研究局（A*STAR）属下新加坡食品与生物技术创新研究所（SIFBI）
杂志: Microbial Cell Factories（2022）
DOI: 10.1186/s12934-022-01746-z
所属领域: 代谢工程
关键词: Acetyl-CoA availabilityAsymmetric homology armsCRISPR-Cas9Cell sizeLycopeneTriacylglycerol pathway
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解决的核心问题

在E. coli BL21中，CRISPR-Cas9介导的基因组编辑效率低且同源臂制备繁琐、成本高，gRNA设计缺乏可靠准则，导致基因组修饰耗时费力。

研究策略

开发CRASH（CRISPR-Cas9和不对称同源臂重组工程）方法，利用单步PCR生成不对称同源臂作为供体DNA，优化gRNA设计启发式规则，结合λ-Red重组酶进行高效基因敲除；并通过敲除细胞大小相关基因、调控三酰甘油合成和增加乙酰-CoA可用性，迭代改造BL21，实现番茄红素高产。

研究路线图

100%

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核心内容

该研究针对大肠杆菌BL21菌株中CRISPR-Cas9基因组编辑效率低、同源臂制备繁琐等瓶颈，开发了CRASH方法。该方法采用单步PCR生成不对称同源臂作为供体DNA，仅需100 ng即可完成编辑，避免了传统克隆步骤；同时通过大规模验证提出了gRNA设计启发式规则，使27个目标基因中26个被成功删除，其中18个基因敲除效率不低于75%，并实现了单轮编辑删除10 kb DNA片段。在此基础上，研究通过迭代组合敲除细胞分裂相关基因（envC、zapB）、调控三酰甘油合成（ΔdgkA）、阻断竞争途径（ΔldhA等）并强化乙酰-CoA供应，系统改造菌株以提升番茄红素产量。最终工程菌株的番茄红素比产率从约15,000 ppm提升至超过40,000 ppm，提高约3倍，其中敲除envC和zapB分别使比产率提高17%和30%。该研究表明CRASH是一种简便高效的BL21基因组编辑工具，其流程可推广至其他大肠杆菌菌株，为微生物代谢工程改造提供了实用策略。

创新点

1. 首次在BL21菌株中优化了CRISPR-Cas9系统，实现单轮编辑删除10 kb DNA。2. 采用不对称同源臂（aHA）通过单步PCR制备供体DNA，仅需100 ng，避免了传统克隆步骤。3. 提出了基于大规模验证的gRNA设计启发式规则，使26/27个基因被成功删除，其中18个基因敲除效率≥75%。4. 通过组合敲除（细胞尺寸增大、TAG途径强化、乙酰-CoA通量增加）使番茄红素比产率从约15,000 ppm提高至>40,000 ppm，提高约3倍。

研究对象（30）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
E. coli BL21-Gold (DE3)	细胞分裂/形态	envC	肽聚糖酰胺酶激活因子EnvC	调控	敲除envC使细胞变长，番茄红素比产率提高17%
E. coli BL21-Gold (DE3)	细胞分裂/形态	zapB	Z环相关蛋白ZapB	调控	敲除zapB使细胞大小增加，番茄红素比产率提高30%，B2菌株包含此敲除
E. coli BL21-Gold (DE3)	脂质代谢	dgkA	二酰甘油激酶DgkA	催化	敲除dgkA增加TAG前体，B3菌株，番茄红素约30,000 ppm
E. coli BL21-Gold (DE3)	脂肪酸β-氧化	fadE	脂酰CoA脱氢酶FadE	催化	敲除fadE提高番茄红素含量，单敲有益
E. coli BL21-Gold (DE3)	混合酸发酵	adhE	乙醇脱氢酶AdhE	催化	敲除adhE增加乙酰-CoA，B4菌株
E. coli BL21-Gold (DE3)	乳酸发酵	ldhA	乳酸脱氢酶LdhA	催化	敲除ldhA增加乙酰-CoA，B5菌株，番茄红素比产率约42,000 ppm（培养4天）
E. coli BL21-Gold (DE3)	芳香族氨基酸生物合成	aroA	5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶	催化	B2菌株中敲除，用于构建营养缺陷型
E. coli BL21-Gold (DE3)	芳香族氨基酸生物合成	aroB	3-脱氢奎尼酸合酶	催化	B2菌株中敲除
E. coli BL21-Gold (DE3)	芳香族氨基酸生物合成	aroC	分支酸合酶	催化	B2菌株中敲除
E. coli BL21-Gold (DE3)	氨基酸生物合成	serC	磷酸丝氨酸转氨酶	催化	B2菌株中敲除
E. coli BL21-Gold (DE3)	甲羟戊酸途径	atoB	乙酰乙酰CoA硫解酶	催化	模块1过表达，合成乙酰乙酰CoA
E. coli BL21-Gold (DE3)	甲羟戊酸途径	hmgs	HMG-CoA合酶	催化	模块1过表达
E. coli BL21-Gold (DE3)	甲羟戊酸途径	thmgR	截短的HMG-CoA还原酶	催化	模块1过表达
E. coli BL21-Gold (DE3)	甲羟戊酸途径	mevK	甲羟戊酸激酶	催化	模块2过表达
E. coli BL21-Gold (DE3)	甲羟戊酸途径	pmk	磷酸甲羟戊酸激酶	催化	模块2过表达
E. coli BL21-Gold (DE3)	甲羟戊酸途径	pmd	甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶	催化	模块2过表达
E. coli BL21-Gold (DE3)	异戊二烯代谢	idi	异戊烯基焦磷酸异构酶	催化	模块2过表达
E. coli BL21-Gold (DE3)	类胡萝卜素生物合成	crtE	GGPP合酶	催化	模块3过表达
E. coli BL21-Gold (DE3)	类胡萝卜素生物合成	crtB	八氢番茄红素合酶	催化	模块3过表达
E. coli BL21-Gold (DE3)	类胡萝卜素生物合成	crtI	八氢番茄红素脱饱和酶	催化	模块3过表达
E. coli BL21-Gold (DE3)	类胡萝卜素生物合成	ispA	法尼基焦磷酸合酶	催化	模块3过表达
E. coli BL21-Gold (DE3)	三酰甘油合成	fadD	长链脂酰CoA连接酶	催化	模块4过表达，来自大肠杆菌或红球菌
E. coli BL21-Gold (DE3)	三酰甘油合成	PAP	磷脂酸磷酸酶	催化	模块4过表达，来自红球菌
E. coli BL21-Gold (DE3)	三酰甘油合成	WS/DGAT	蜡酯合酶/二酰甘油酰基转移酶	催化	模块4过表达，来自Acinetobacter baylyi或Thermomonospora curvata
E. coli BL21-Gold (DE3)	细胞分裂/形态	holD	DNA聚合酶IIIψ亚基	催化	敲除后细胞形态异常，但未提高产量
E. coli BL21-Gold (DE3)	蛋白质转运	tatA	双精氨酸转运蛋白TatA	转运	敲除后细胞形态异常，未采用
E. coli BL21-Gold (DE3)	细胞骨架	rodZ	RodZ蛋白	调控	多次尝试敲除未成功，因下游ispG必需
E. coli BL21-Gold (DE3)	丙酮酸代谢	poxB	丙酮酸氧化酶	催化	敲除后提高特定产量，但生长减慢
E. coli BL21-Gold (DE3)	丙酮酸代谢	pflB	丙酮酸甲酸裂解酶	催化	敲除后提高特定产量
E. coli BL21-Gold (DE3)	乙酸代谢	ackA-pta	乙酸激酶-磷酸转乙酰酶	催化	敲除后产量最高但生长极慢

关键发现

优化CRISPR-Cas9在BL21中的基因敲除，成功删除10 kb DNA
使用不对称同源臂（U50D500）获得近100%敲除效率
gRNA3靶向adhE效率近100%
成功删除26/27个基因，18个基因效率≥75%
敲除envC和zapB分别使番茄红素比产率提高17%和30%
B3菌株（ΔdgkA）约30,000 ppm
过表达TAG途径（DTP1b）后约35,000 ppm
B5菌株（ΔldhA）培养4天后比产率约42,000 ppm，产量约135 mg/L
最终比产率从约15,000 ppm提高至>40,000 ppm。

研究结论

该研究建立的CRASH方法能高效编辑E. coli BL21基因组，并通过多策略组合显著提高番茄红素产量，该流程可推广至其他大肠杆菌菌株，为代谢工程提供了一种简便高效的基因组编辑工具。