Expressing a cytosolic pyruvate dehydrogenase complex to increase free fatty acid production in Saccharomyces cerevisiae
- 作者
- Yiming Zhang, Mo Su, Ning Qin, Jens Nielsen, Zihe Liu
- 单位
- Beijing Advanced Innovation Center for Soft Matter Science and Engineering, College of Life Science and Technology, Beijing University of Chemical Technology; Department of Biology and Biological Engineering, Chalmers University of Technology; BioInnovation Institute
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2020）
- DOI
- 10.1186/s12934-020-01493-z
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在酿酒酵母中，游离脂肪酸（FFA）生产受限于乙酰-CoA 供应不足和胞质氧化还原不平衡。传统乙酰-CoA 合成途径存在碳损失或高 ATP 消耗，且脂肪酸合成需要大量 NADPH，而糖酵解产生的 NADH 过多导致甘油积累。
研究策略
异源表达粪肠球菌的胞质丙酮酸脱氢酶（PDH）复合物以低 ATP 成本提供乙酰-CoA；通过删除内源 GPD1/GPD2 和表达 NADP+ 依赖的 GapN 来平衡 NAD/NADP 氧化还原状态；同时结合脂肪酸代谢去调控（删除 FAA1, FAA4, POX1, HFD1, PAH1, DPP1, LPP1, ARE1）以提高 FFA 产量。
核心内容
针对酿酒酵母游离脂肪酸生产中乙酰-CoA供应不足与胞质氧化还原失衡的问题，该研究将粪肠球菌胞质丙酮酸脱氢酶复合物异源表达于酿酒酵母，以低ATP成本合成乙酰-CoA，同时删除内源GPD1/GPD2并引入NADP+依赖的GapN以平衡NAD/NADP状态，并敲除FAA1、FAA4、POX1等脂肪酸代谢相关基因进行去调控。结果显示，表达PDH复合物显著提高游离脂肪酸产量并改善细胞生长，最佳菌株PDH7在摇瓶中的产量达840.5 mg/L，较对照菌株的458.9 mg/L提升83.2%，且主要增加不饱和脂肪酸（C16:1和C18:1）比例。PDH表达降低了胞内NADH/NAD+比值，而GapN进一步将甘油降至0.58 g/L并部分恢复双缺失导致的生长缺陷。该研究证明胞质PDH通路可作为高效的乙酰-CoA供应策略，结合辅因子再平衡能显著提升游离脂肪酸产量，并因不饱和脂肪酸比例增加而在相关衍生物生产中具有应用潜力。
创新点
首次将粪肠球菌 PDH 复合物与脂肪酸去调控和辅因子工程相结合；证明了 PDH 表达能增加不饱和脂肪酸比例；构建的 PDH7 菌株达到与最佳乙酰-CoA 途径相当的高水平 FFA 生产。
研究对象（20）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | 胞质乙酰-CoA 合成 | pdhA | 丙酮酸脱氢酶 E1α亚基 | 催化 | 来自粪肠球菌的 PDH 复合物亚基，与 pdhB/aceF/lpd 共同表达 |
| Saccharomyces cerevisiae | 胞质乙酰-CoA 合成 | pdhB | 丙酮酸脱氢酶 E1β亚基 | 催化 | 来自粪肠球菌的 PDH 复合物亚基 |
| Saccharomyces cerevisiae | 胞质乙酰-CoA 合成 | aceF | 二氢硫辛酰转乙酰酶 E2 | 催化 | 来自粪肠球菌的 PDH 复合物亚基 |
| Saccharomyces cerevisiae | 胞质乙酰-CoA 合成 | lpd | 二氢硫辛酰脱氢酶 E3 | 催化 | 来自粪肠球菌的 PDH 复合物亚基 |
| Saccharomyces cerevisiae | 硫辛酸辅助因子合成 | lplA | 硫辛酸连接酶 | 催化 | 来自粪肠球菌，用于 PDH 复合物组装 |
| Saccharomyces cerevisiae | 硫辛酸辅助因子合成 | lplA2 | 硫辛酸连接酶同工酶 | 催化 | 来自粪肠球菌，用于 PDH 复合物组装 |
| Saccharomyces cerevisiae | 糖酵解/NADPH 再生 | GapN | NADP+ 依赖的甘油醛-3-磷酸脱氢酶 | 催化 | 来自变异链球菌，不可逆转化 G3P 为 3PG，产生 NADPH |
| Saccharomyces cerevisiae | 甘油合成 | GPD1 | NAD+ 依赖的甘油-3-磷酸脱氢酶 1 | 催化 | 内源基因，被删除以减少甘油积累 |
| Saccharomyces cerevisiae | 甘油合成 | GPD2 | NAD+ 依赖的甘油-3-磷酸脱氢酶 2 | 催化 | 内源基因，被删除以减少甘油积累 |
| Saccharomyces cerevisiae | 脂肪酸活化 | FAA1 | 酰基-CoA 合成酶 1 | 催化 | 内源基因，被删除以阻止脂肪酸再活化 |
| Saccharomyces cerevisiae | 脂肪酸活化 | FAA4 | 酰基-CoA 合成酶 4 | 催化 | 内源基因，被删除以阻止脂肪酸再活化 |
| Saccharomyces cerevisiae | β-氧化 | POX1 | 酰基-CoA 氧化酶 | 催化 | 内源基因，被删除以阻断β-氧化 |
| Saccharomyces cerevisiae | 脂肪酸降解 | HFD1 | 脂肪醛脱氢酶 | 催化 | 内源基因，被删除以阻断脂肪酸降解 |
| Saccharomyces cerevisiae | 脂质代谢 | PAH1 | 磷脂酸磷酸酶 PAH1 | 催化 | 内源基因，被删除以去调控脂质合成 |
| Saccharomyces cerevisiae | 脂质代谢 | DPP1 | 磷脂酸磷酸酶 DPP1 | 催化 | 内源基因，被删除以去调控脂质合成 |
| Saccharomyces cerevisiae | 脂质代谢 | LPP1 | 磷脂酸磷酸酶 LPP1 | 催化 | 内源基因，被删除以去调控脂质合成 |
| Saccharomyces cerevisiae | 固醇酯合成 | ARE1 | 固醇酯转移酶 ARE1 | 催化 | 内源基因，被删除以减少固醇酯形成 |
| Saccharomyces cerevisiae | 固醇酯合成 | ARE2 | 固醇酯转移酶 ARE2 | 催化 | 内源基因，被删除以减少固醇酯形成 |
| Saccharomyces cerevisiae | 磷酸转酮酶途径 | XpkA | 木酮糖-5-磷酸磷酸酮醇酶 | 催化 | 来自肠膜明串珠菌，与 Pta 共表达测试，未显著提高 FFA |
| Saccharomyces cerevisiae | 磷酸转酮酶途径 | Pta | 磷酸转乙酰酶 | 催化 | 来自克氏梭菌，与 XpkA 共表达测试，未显著提高 FFA |
关键发现
- 表达 PDH 复合物显著提高了 FFA 产量，改善了细胞生长和乙醇消耗，降低了甘油积累。最佳菌株 PDH7 在摇瓶中产生
- 5 mg/L 游离脂肪酸，比对照菌株 YJZ08 的
- 9 mg/L 高
- 2%。PDH 表达主要增加不饱和脂肪酸（C16:1 和 C18:1）。GapN 表达进一步降低甘油水平（PDH6 为
- 58 g/L），但 GPD 双缺失导致生长下降，通过 GapN 可部分恢复。PDH 表达降低了胞内 NADH/NAD+ 比值。
研究结论
胞质 PDH 通路提供了一种低 ATP 成本的乙酰-CoA 供应方式，显著提高 FFA 产量。结合辅因子再平衡，PDH7 达到高水平 FFA 生产。PDH 表达还增加了不饱和 FFA 比例，可用于不饱和脂肪酸及其衍生物的生产。