Construction of a novel MK-4 biosynthetic pathway in Pichia pastoris through heterologous expression of HsUBIAD1
- 作者
- Xiaowen Sun, Hui Liu, Peng Wang, Li wang, Wenfeng Ni, Qiang Yang, Han Wang, Hengfang Tang, Genhai Zhao, Zhiming Zheng
- 单位
- Key Laboratory of High Magnetic Field and Ion Beam Physical Biology, Hefei Institutes of Physical Science, Chinese Academy of Sciences, Hefei 230031, Anhui, People's Republic of China; University of Science and Technology of China, Hefei 230026, Anhui, People's Republic of China
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2019）
- DOI
- 10.1186/s12934-019-1215-9
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）中缺乏甲萘醌生物合成途径，无法自身合成甲萘醌-4（MK-4），需要异源构建该途径以实现高附加值异戊烯基化合物的生产。
研究策略
通过异源表达人源UBIAD1（HsUBIAD1）在毕赤酵母中构建MK-4合成途径；使用组成型启动子P_GAP驱动表达并优化培养条件；通过整合rDNA多拷贝表达外源SaGGPPS及融合表达PpIDI，增强GGPP前体供应，提高MK-4产量。
核心内容
该研究在巴斯德毕赤酵母中首次构建了甲萘醌-4（MK-4）的异源生物合成途径，通过表达人源UBIAD1实现全细胞催化合成。研究者选用组成型启动子P_GAP驱动HsUBIAD1表达，避免甲醇诱导的安全风险，并系统优化了培养条件。结果显示，在pH 7.0、24°C条件下培养36小时，HsUBIAD1表达量提高4.37倍；在pH 7.0、31°C及Mg²⁺存在时酶活性提升229%。为进一步增强异戊烯基供体GGPP的供应，采用rDNA介导的多拷贝整合策略强化源自硫化叶菌的SaGGPPS表达，并将SaGGPPS与毕赤酵母内源PpIDI融合表达，所得菌株MK-4产量比仅表达SaGGPPS的菌株高140%。最终以VK3为受体，MK-4产量达到0.24 mg/g DCW。该工作证明通过异源表达和代谢工程手段可在酵母中重建复杂异戊烯基化合物合成路径，为其他类异戊烯基天然产物的微生物生产提供了可借鉴的通用策略。
创新点
首次在巴斯德毕赤酵母中构建MK-4异源生物合成途径；比较并选用组成型启动子P_GAP实现无需甲醇的安全表达；利用rDNA介导的多拷贝整合增强SaGGPPS表达；采用SaGGPPS与PpIDI融合表达策略促进GGPP积累，实现了MK-4的全细胞催化合成。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia pastoris GS115 | MK-4生物合成途径（异源） | HsUBIAD1 | HsUBIAD1 | 催化 | 人源UbiA异戊烯基转移酶，催化VK1/VK3与GGPP生成MK-4 |
| Pichia pastoris GS115 | 异戊二烯代谢途径 | ggpps（源自Sulfolobus acidocaldarius） | SaGGPPS | 催化 | 香叶基香叶基二磷酸合酶，通过连续缩合IPP/DMAPP合成GGPP，增强前体供应 |
| Pichia pastoris GS115 | 异戊二烯代谢途径 | idi（源自毕赤酵母） | PpIDI | 催化 | 异戊烯基焦磷酸异构酶，催化IPP与DMAPP互变，与SaGGPPS融合表达以促进GGPP合成 |
关键发现
- 通过异源表达HsUBIAD1在毕赤酵母中成功构建MK-4合成途径。优化培养条件（pH
- 0、24°C、36 h）后，HsUBIAD1表达量提高4.37倍；在pH
- 0、31°C和Mg2+存在下，HsUBIAD1活性提高229%。重组菌GGU-23比GPU-23的HsUBIAD1产量高105.8%。融合表达SaGGPPS和PpIDI的GGU-GrIG菌株MK-4产量比仅表达SaGGPPS的GGU-GrG高140%。最终以VK3为异戊烯基受体，MK-4产量达0.24 mg/g DCW。
研究结论
通过在巴斯德毕赤酵母中异源表达HsUBIAD1并增强GGPP供应，成功构建了新型MK-4生物合成途径。通过启动子选择、表达条件优化和代谢工程策略，MK-4产量达到0.24 mg/g DCW。该策略可推广至其他异戊烯基化合物的生物合成，具有理论研究与工业应用价值。