The damage and tolerance mechanisms of Phaffia rhodozyma mutant strain MK19 grown at \(28^{\circ}C\)
- 作者
- Li-Li Miao, Shuang Chi, Ting-Ting Hou, Zhi-Pei Liu, Ying Li
- 单位
- State Key Laboratory of Microbial Resources, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, People's Republic of China; State Key Laboratories for Agro-biotechnology and College of Biological Sciences, China Agricultural University, Beijing 100193, People's Republic of China
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2021）
- DOI
- 10.1186/s12934-020-01479-x
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
野生型Phaffia rhodozyma在28°C下无法生长且虾青素合成受到抑制，而工业发酵需要较高温度。该研究旨在揭示高温对细胞生长和虾青素合成的损伤机制，以及中温突变株MK19在28°C下的耐受和补偿机制。
研究策略
利用RNA-Seq转录组学比较MK19在21°C和28°C下的基因表达差异，并结合脂肪酸、麦角固醇、虾青素、DNA/RNA/蛋白质含量及细胞壁结构等代谢表型分析，与野生型JCM9042对照，解析高温胁迫下的分子调控网络。
核心内容
该研究利用RNA-Seq转录组学结合代谢表型分析，系统揭示了高温对法夫酵母（Phaffia rhodozyma）生长与虾青素合成的损伤机制，并阐明了中温突变株MK19在28°C下的耐受与补偿机制。结果显示，28°C下野生型因DNA和RNA合成受阻、脂肪酸合成下降（总脂肪酸约为21°C的50%）、细胞壁完整性受损（细胞壁总厚度从0.46 μm降至0.38 μm）而无法生长。MK19则通过积累麦角固醇至7500 μg/g（约为21°C的2倍）部分补偿脂肪酸不足，并在100 h达到6 g/L生物量；同时虾青素含量超过2000 μg/g，约为低温下的2倍。转录组分析定位高温抑制虾青素合成的关键步骤为crtI催化的脱氢反应，MK19中crtI表达量比野生型高10倍以上，是其耐高温的重要原因。此外，MVA途径关键基因和12个热休克蛋白显著上调。该研究首次系统阐明高温下虾青素合成与脂肪酸合成呈负相关，提出强化MVA途径是提升虾青素产量的有效代谢工程策略。
创新点
['首次系统揭示P. rhodozyma在28°C下生长抑制的分子机制，包括DNA/RNA合成阻断、脂肪酸合成下降、细胞壁完整性受损等', '发现MK19在28°C下麦角固醇积累至7500 μg/g（约为21/25°C的2倍），可部分补偿脂肪酸缺乏，使生物量达到6 g/L', '证明高温下虾青素合成与脂肪酸合成呈负相关，MVA途径被激活，提出强化MVA途径是提高虾青素产量的可行策略', '定位高温抑制虾青素合成的关键步骤为crtI催化的八氢番茄红素到番茄红素的脱氢反应，MK19中crtI高表达（>10倍于WT）是其耐受高温的重要原因']
研究对象（15）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Phaffia rhodozyma MK19 | 脂肪酸合成 | acc1 | 乙酰-CoA羧化酶 | 催化 | 28°C下mRNA含量仅为21°C的25%，导致脂肪酸合成显著下降 |
| Phaffia rhodozyma MK19 | 脂肪酸合成 | fas1 | 脂肪酸合酶β亚基 | 催化 | 28°C下mRNA含量下调至对照的0.40倍 |
| Phaffia rhodozyma MK19 | 脂肪酸合成 | fas2 | 脂肪酸合酶α亚基 | 催化 | 28°C下mRNA含量下调至对照的0.29倍 |
| Phaffia rhodozyma MK19 | 脂肪酸合成 | fad | 脂肪酸脱饱和酶 | 催化 | 28°C下mRNA含量下调至0.32倍，影响不饱和脂肪酸合成 |
| Phaffia rhodozyma MK19 | MVA/异戊二烯合成 | hmgs | HMG-CoA合酶 | 催化 | 28°C下表达未受抑制，参与麦角固醇和虾青素前体合成 |
| Phaffia rhodozyma MK19 | MVA/异戊二烯合成 | hmgr | HMG-CoA还原酶 | 催化 | 28°C下表达无显著变化 |
| Phaffia rhodozyma MK19 | MVA/异戊二烯合成 | idi | 异戊烯基焦磷酸异构酶 | 催化 | 28°C下转录被诱导，最高约10倍于21°C |
| Phaffia rhodozyma MK19 | 类胡萝卜素合成 | crtE | GGPP合酶 | 催化 | 28°C下表达略上调 |
| Phaffia rhodozyma MK19 | 类胡萝卜素合成 | crtI | 八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | MK19中表达量比WT高>10倍，28°C下降低1.5倍，但足以维持高效脱氢 |
| Phaffia rhodozyma MK19 | 类胡萝卜素合成 | pbs | 八氢番茄红素-β-胡萝卜素合酶 | 催化 | 双功能酶，兼具番茄红素环化酶活性，28°C下表达无显著差异 |
| Phaffia rhodozyma MK19 | 类胡萝卜素合成 | ast | 虾青素合酶 | 催化 | 28°C下表达无显著差异 |
| Phaffia rhodozyma MK19 | 麦角固醇合成 | sqs | 鲨烯合酶 | 催化 | 28°C下表达无显著变化，但麦角固醇含量增加2倍 |
| Phaffia rhodozyma MK19 | 热激响应 | HSP70 | 热休克蛋白70 | 调控 | 28°C下显著上调，参与蛋白折叠与保护 |
| Phaffia rhodozyma MK19 | 热激响应 | HSP90 | 热休克蛋白90 | 调控 | RNA-Seq显示28°C下上调12.06倍 |
| Phaffia rhodozyma MK19 | 细胞壁完整性信号 | wsc1 | WSC结构域蛋白 | 调控 | 8/12个WSC基因在28°C下mRNA极低，细胞壁完整性受损 |
关键发现
['MK19在28°C下培养100 h生物量达6 g/L，比21/25°C低约80%', '28°C下虾青素含量>2000 μg/g，约为21/25°C的2倍', '28°C下麦角固醇含量达7500 μg/g，约为21/25°C的2倍', '28°C下总脂肪酸含量约为21°C的50%，其中18:1脂肪酸显著降低', '28°C下DNA含量比21°C低3倍以上，RNA合成受抑制', '细胞壁总厚度从21°C的0.46 μm降至28°C的0.38 μm，甘露糖层厚度从0.26 μm降至0.15 μm', 'acc1基因mRNA在28°C下仅为21°C的25%', 'crtI基因在MK19中表达量比WT高>10倍，但28°C下降低1.5倍', '12个热休克蛋白基因显著上调，如HSP90上调12.06倍（RNA-Seq）']
研究结论
P. rhodozyma在28°C下的生长抑制源于DNA、RNA、脂肪酸和细胞壁生物合成的阻断。突变株MK19通过积累麦角固醇、葡聚糖和蛋白质等补偿机制，在28°C下仍可产生6 g/L生物量。虾青素和麦角固醇的大量积累表明MVA途径在此温度下被激活，强化MVA途径是提高虾青素合成的有效代谢工程策略。