Different transcriptional responses of haploid and diploid S. cerevisiae strains to changes in cofactor preference of XR
- 作者
- Cai-Yun Xie, Bai-Xue Yang, Qing-Ran Song, Zi-Yuan Xia, Min Gou, Yue-Qin Tang
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2020）
- DOI
- 10.1186/s12934-020-01474-2
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析突变木糖还原酶（XR）辅因子偏好改变后，单倍体和二倍体酿酒酵母在木糖发酵中呈现不同代谢表型的转录调控机制。
研究策略
构建表达野生型或NADH偏好型突变XR（K270R/N272D）的单倍体（HX62W/HX57D）和二倍体（B/A）工业酿酒酵母菌株，通过RNA-seq比较不同倍性下突变XR引起的全局转录组变化，并结合发酵表型和酶活分析。
核心内容
该研究在工业酿酒酵母中系统比较了表达NADH偏好型突变木糖还原酶（XR K270R/N272D）与野生型XR的单倍体和二倍体菌株在木糖发酵中的转录组与代谢表型差异。通过CRISPR/Cas9无标记整合构建四株菌，结合RNA-seq、发酵参数及酶活分析发现，突变XR对代谢的影响强烈依赖宿主倍性：单倍体HX57D较HX62W木糖消耗率提高34%，乙醇产量更高，但生物量降低43%；二倍体中突变株A乙醇产量高于对照B，生物量反而增加57%。酶活层面，HX57D的NADH-XR活性较对照高139%，而菌株A的NADPH-XR和XDH活性分别低77.3%和39.9%。转录组显示单倍体上调木糖同化、糖酵解和乙醇发酵基因，二倍体则上调蛋白合成基因并下调乙醛酸支路，且二倍体整体糖酵解和MAPK信号基因显著下调。结果表明，单倍体倾向于将木糖作为发酵碳源，二倍体则偏向非发酵利用，为按倍性定制木糖发酵菌株提供了转录层面的理论依据。
创新点
首次在工业酿酒酵母中从转录水平系统比较突变XR和倍性增加对木糖代谢的影响；利用CRISPR/Cas9实现无标记多基因整合。
研究对象（18）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 酿酒酵母单倍体菌株（HX57D/HX62W） | 木糖同化途径 | XYL1 | 木糖还原酶（XR） | 催化 | 表达野生型或NADH偏好突变型（K270R/N272D） |
| 酿酒酵母单倍体菌株（HX57D/HX62W） | 木糖同化途径 | XYL2 | 木糖醇脱氢酶（XDH） | 催化 | 来自Scheffersomyces stipitis |
| 酿酒酵母单倍体菌株（HX57D/HX62W） | 木糖同化途径 | XKS1 | 木糖激酶（XK） | 催化 | 来自酿酒酵母 |
| 酿酒酵母单倍体菌株（HX57D/HX62W） | 戊糖磷酸途径 | TAL1 | 转醛醇酶 | 催化 | 在HX57D中上调 |
| 酿酒酵母单倍体菌株（HX57D/HX62W） | 戊糖磷酸途径 | GND1 | 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶 | 催化 | 在HX57D中上调 |
| 酿酒酵母单倍体菌株（HX57D/HX62W） | 乙醇发酵 | PDC1 | 丙酮酸脱羧酶 | 催化 | 在HX57D中上调 |
| 酿酒酵母单倍体菌株（HX57D/HX62W） | 乙醇发酵 | ADH1 | 醇脱氢酶 | 催化 | 在HX57D中上调 |
| 酿酒酵母单倍体菌株（HX57D/HX62W） | 甘油代谢 | GPD1 | NADH依赖性甘油-3-磷酸脱氢酶 | 催化 | 在HX57D中下调 |
| 酿酒酵母二倍体菌株（A/B） | 甘油代谢 | GPD1 | NADH依赖性甘油-3-磷酸脱氢酶 | 催化 | 在A中上调 |
| 酿酒酵母二倍体菌株（A/B） | 蛋白生物合成 | GCR1 | Gcr1p转录因子 | 调控 | 在A中上调，激活糖酵解基因和核糖体蛋白合成 |
| 酿酒酵母单倍体菌株（HX57D/HX62W） | 糖转运 | HXT4 | 己糖转运蛋白4 | 转运 | 在HX57D中上调 |
| 酿酒酵母二倍体菌株（A/B） | 糖转运 | HXT2 | 己糖转运蛋白2 | 转运 | 在A中下调 |
| 酿酒酵母二倍体菌株（A/B） | 糖转运 | HXT13 | 己糖转运蛋白13 | 转运 | 在A中上调 |
| 酿酒酵母二倍体菌株（A/B） | 糖转运 | HXT17 | 己糖转运蛋白17 | 转运 | 在A中上调 |
| 酿酒酵母二倍体菌株（A/B） | 糖转运 | GAL2 | 半乳糖透性酶 | 转运 | 在A中上调 |
| 酿酒酵母单倍体菌株（HX57D/HX62W） | 乙醛酸支路 | ICL1 | 异柠檬酸裂合酶 | 催化 | 在HX57D中下调 |
| 酿酒酵母二倍体菌株（A/B） | 乙醛酸支路 | MLS1 | 苹果酸合酶 | 催化 | 在A中上调 |
| 酿酒酵母二倍体菌株（A/B） | 糖代谢调控 | CAT8 | Cat8p转录因子 | 调控 | 在二倍体中上调，参与非发酵碳源代谢调控 |
关键发现
- 单倍体HX57D比HX62W木糖消耗率高34%，乙醇产量高
- 二倍体A乙醇产量高于B但木糖消耗率相近。HX57D生物量比HX62W低43%，而A比B高57%。HX57D的NADPH-XR、NADH-XR和XDH活性分别比HX62W高25%、139%和70%
- A的NADH-XR活性比B高19.2%，但NADPH-XR和XDH活性分别低77.3%和39.9%。转录组分析表明，单倍体中木糖同化、糖酵解和乙醇发酵相关基因上调，而二倍体中蛋白生物合成相关基因上调、乙醛酸支路相关基因下调。二倍体相对于单倍体，糖酵解和MAPK信号通路基因显著下调，氧化应激相关转录因子上调。
研究结论
突变XR对木糖代谢的影响与宿主倍性密切相关：在单倍体中促进木糖消耗和乙醇生产，在二倍体中主要促进生物量积累。单倍体倾向于将木糖视为发酵碳源，二倍体则视为非发酵碳源。该研究为高效木糖发酵菌株的构建提供了理论依据。