Heterologous production of novel and rare C30-carotenoids using Planococcus carotenoid biosynthesis genes
- 作者
- Miho Takemura, Chiharu Takagi, Mayuri Aikawa, Kanaho Araki, Seon-Kang Choi, Mitsuhiro Itaya, Kazutoshi Shindo, Norihiko Misawa
- 单位
- Research Institute for Bioresources and Biotechnology, Ishikawa Prefectural University; Department of Food and Nutrition, Japan Women's University; Department of Agriculture and Life Industry, Kangwon National University; Department of Biomedical Engineering, Graduate School of Science and Technology, Shinshu University
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2021）
- DOI
- 10.1186/s12934-021-01683-3
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
从海洋细菌Planococcus maritimus strain iso-3中分离并鉴定参与C30-类胡萝卜素生物合成的基因，并在大肠杆菌中通过基因组合异源生产具有抗氧化活性的新型和稀有C30-类胡萝卜素。
研究策略
通过功能克隆和反向PCR从P. maritimus基因组中获得类胡萝卜素生物合成基因簇；在大肠杆菌中异源表达各候选基因进行功能鉴定；利用组合表达构建完整或部分生物合成途径生产目标类胡萝卜素；通过质谱和核磁共振确定新化合物结构，并测定单线态氧淬灭活性。
核心内容
研究从海洋细菌Planococcus maritimus strain iso-3中克隆并功能鉴定了包含7个开放阅读框的C30-类胡萝卜素生物合成基因簇，确认orf3、orf1、orf4、orf5和orf7分别编码4,4'-diapophytoene合成酶、脱氢酶、新型脱氢酶、糖基转移酶和diaponeurosporene水合酶。其中orf7编码的CruF是一种此前未知的水合酶，而orf4编码的CrtNb功能与已知醛合酶不同。将这些基因在大肠杆菌JM101(DE3)中组合表达，成功生产了5种中间体类胡萝卜素，包括两种新型化合物5-羟基-5,6-二氢-4,4'-diaponeurosporene（产量10.8 mg/L）和5-葡萄糖基-5,6-二氢-4,4'-diapolycopene（2.6 mg/L），以及一种稀有化合物5-羟基-5,6-二氢-4,4'-diapolycopene（2.2 mg/L），结构经质谱和核磁共振确认。单线态氧淬灭活性测定显示这些化合物的IC50值在30–56 μM之间，弱于虾青素（3.7 μM）但具中等活性。该工作提供了新的C30-类胡萝卜素合成基因和途径，为这类稀有抗氧化色素的微生物异源生产奠定了基础。
创新点
首次从P. maritimus中分离并功能鉴定了类胡萝卜素生物合成基因簇；发现orf7编码一种新型diaponeurosporene水合酶（CruF）；发现crtNb编码的脱氢酶功能不同于已知的醛合酶；生产出两种新型C30-类胡萝卜素（5-羟基-5,6-二氢-4,4'-diaponeurosporene和5-葡萄糖基-5,6-二氢-4,4'-diapolycopene）和一种稀有C30-类胡萝卜素（5-羟基-5,6-二氢-4,4'-diapolycopene），并测定了其单线态氧淬灭活性。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli JM101(DE3) | C30类胡萝卜素生物合成 | orf3 (crtM) | 4,4'-diapophytoene synthase | 催化 | 催化FPP生成15-cis-4,4'-diapophytoene |
| Escherichia coli JM101(DE3) | C30类胡萝卜素生物合成 | orf1 (crtNa) | 4,4'-diapophytoene desaturase | 催化 | 催化15-cis-4,4'-diapophytoene脱氢生成4,4'-diaponeurosporene |
| Escherichia coli JM101(DE3) | C30类胡萝卜素生物合成 | orf7 (cruF) | diaponeurosporene hydratase | 催化 | 催化4,4'-diaponeurosporene水合生成5-羟基-5,6-二氢-4,4'-diaponeurosporene |
| Escherichia coli JM101(DE3) | C30类胡萝卜素生物合成 | orf4 (crtNb) | 5-hydroxy-5,6-dihydro-4,4'-diaponeurosporene desaturase | 催化 | 催化5-羟基-5,6-二氢-4,4'-diaponeurosporene脱氢生成5-羟基-5,6-二氢-4,4'-diapolycopene |
| Escherichia coli JM101(DE3) | C30类胡萝卜素生物合成 | orf5 (GT) | glycosyltransferase | 催化 | 催化5-羟基-5,6-二氢-4,4'-diapolycopene糖基化生成5-葡萄糖基-5,6-二氢-4,4'-diapolycopene |
| Escherichia coli JM101(DE3) | 萜类前体供给 | idi (来自Haematococcus pluvialis) | isopentenyl diphosphate isomerase | 催化 | 增强IPP异构化，提高类胡萝卜素产量 |
| Escherichia coli JM101(DE3) | C30类胡萝卜素生物合成 | crtM和crtN (来自Leuconostoc mesenteroides) | CrtM和CrtN | 催化 | 用于构建质粒以提供C30前体或脱氢功能 |
| Bacillus subtilis MI112 | C30类胡萝卜素生物合成 | 未指定（P. maritimus基因簇片段） | 未知 | 催化 | 用于功能克隆筛选黄色菌落，宿主自身具有脱氢酶活性 |
关键发现
从P. maritimus中分离出包含7个ORF的类胡萝卜素生物合成基因簇，经功能分析鉴定orf3、orf1、orf4、orf5、orf7分别编码CrtM（4,4'-diapophytoene合成酶）、CrtNa（4,4'-diapophytoene脱氢酶）、CrtNb（5-羟基-5,6-二氢-4,4'-diaponeurosporene脱氢酶）、糖基转移酶（GT）和diaponeurosporene水合酶（CruF）。在大肠杆菌中组合表达这些基因，生产了5种中间体类胡萝卜素，其中两种为新型化合物，一种为稀有化合物。产量：5-羟基-5,6-二氢-4,4'-diaponeurosporene (3)为10.8 mg/L，5-羟基-5,6-二氢-4,4'-diapolycopene (4)为2.2 mg/L，5-葡萄糖基-5,6-二氢-4,4'-diapolycopene (5)为2.6 mg/L。单线态氧淬灭活性IC50值：1 >100 μM，2为45 μM，3为56 μM，4和5均为30 μM，而甲基5-葡萄糖基-5,6-二氢-4,4'-diapolycopenoate为5.1 μM，虾青素为3.7 μM。
研究结论
成功从P. maritimus strain iso-3中分离并功能鉴定了五个类胡萝卜素生物合成基因（crtM、crtNa、crtNb、cruF和GT）。利用这些基因在大肠杆菌中生产了两种新型C30-类胡萝卜素和一种稀有C30-类胡萝卜素，并证明这些化合物具有中等的单线态氧淬灭活性。该研究为C30-类胡萝卜素的异源生产提供了新基因和途径。