Metabolic engineering for high yield synthesis of astaxanthin in Xanthophyllomyces dendrorhous
- 作者
- Alejandro Torres- Haro, Jorge Verdin, Manuel R. Kirchmayr, Melchor Arellano- Plaza
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2021）
- DOI
- 10.1186/s12934-021-01664-6
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
Xanthophyllomyces dendrorhous 天然虾青素产量低（200-400 μg/g干重），化学合成产生外消旋混合物且生物活性低，需要代谢工程手段提高（3R,3'R）-虾青素的生物合成产量。
研究策略
系统分析虾青素生物合成途径的碳代谢流，整合基因组、转录组、蛋白质组数据以及随机突变和定点突变菌株的研究结果，提出新的代谢工程靶点，如调控 Mig1、Sre1、CYP61 等，并通过过表达 HMG1、crtYB、crtS 等关键酶来提高产量。
核心内容
该研究以法夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous）为底盘，系统梳理了虾青素生物合成途径的碳代谢流，整合基因组、转录组、蛋白质组数据以及经典随机突变和定点突变菌株的研究结果，提出了提高（3R,3'R）-虾青素产量的综合代谢工程策略。野生型菌株天然产生约97%的非酯化（3R,3'R）-虾青素，但产量仅为200–400 μg/g干重。通过过表达HMG1、crtYB、crtS等关键酶，并结合敲除CYP61以减少甾醇途径的碳竞争，可显著提升产量：CYP61敲除使HMG1表达提高2–5倍，虾青素产量提高1.4倍；工程菌AXJ-20/crtYB产量超过9.7 mg/g干重；Mig1表达下调可使crtYB和crtS表达提高2倍。此外，用20 g/L琥珀酸替代葡萄糖可使虾青素产量提高2.5倍。研究还比较了在酿酒酵母中异源表达类胡萝卜素途径的策略，最高实现虾青素产量8.1 mg/g。上述结果表明，通过多组学指导的代谢工程结合发酵优化，可将法夫酵母的虾青素产量提升一个数量级以上，但若要实现与化学合成竞争的工业化水平，仍需进一步优化碳代谢流分配并解除甾醇合成等竞争途径的瓶颈限制。
创新点
提出结合多组学数据与经典突变策略的综合代谢工程思路；强调通过调节碳代谢流向、减少甾醇竞争、增强 NADPH 供给和缓解瓶颈酶限制来提高虾青素产量；提出利用 Mig1 抑制消除、Sre1 活性增强、CYP61 敲除等新靶点。
研究对象（16）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 甲羟戊酸途径 | HMG1 | 羟甲基戊二酰辅酶A还原酶 | 催化 | 甲羟戊酸途径限速酶，过表达可提高类胡萝卜素前体供给 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 甲羟戊酸途径 | ERG12 | 甲羟戊酸激酶 | 催化 | 受异戊二烯产物反馈抑制，是潜在限速步骤 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 类胡萝卜素生物合成 | crtYB | 八氢番茄红素-β-胡萝卜素合酶 | 催化 | 双功能酶，催化八氢番茄红素合成及环化，过表达可提高β-胡萝卜素和虾青素产量 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 类胡萝卜素生物合成 | crtI | 八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | 过表达会导致代谢流偏向托鲁烯和HDCO，需控制表达水平 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 类胡萝卜素生物合成 | crtS | 虾青素合酶 | 催化 | 催化β-胡萝卜素羟基化和酮基化，是虾青素合成最后一步的限速酶 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 类胡萝卜素生物合成 | crtR | 细胞色素P450还原酶 | 催化 | 为虾青素合酶提供电子，与crtS协同作用 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 类胡萝卜素生物合成 | crtE | 香叶基香叶基焦磷酸合酶 | 催化 | 催化IPP与FPP缩合生成GGPP |
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 甲羟戊酸途径 | idi | 异戊烯基焦磷酸异构酶 | 催化 | 催化IPP与DMAPP异构化 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 甾醇生物合成 | CYP61 | C-22甾醇脱饱和酶 | 催化 | 敲除可减少麦角甾醇合成，解除对HMG1的反馈抑制，提高虾青素产量 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 甾醇生物合成 | CYP51 | 羊毛甾醇14α-脱甲基酶 | 催化 | 参与麦角甾醇合成，竞争碳代谢流 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 类胡萝卜素生物合成调控 | Mig1 | Mig1转录抑制因子 | 调控 | 葡萄糖阻遏相关，下调表达可解除对crtYB和crtS的抑制 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 甾醇/类胡萝卜素调控 | SRE1 | 甾醇调控元件结合蛋白 | 调控 | 调节甾醇和类胡萝卜素基因表达，N端结构域过表达可提高ERG13和HMG1表达 |
| Saccharomyces cerevisiae | 类胡萝卜素生物合成 | crtZ | β-胡萝卜素羟化酶 | 催化 | 来源于雨生红球藻，将角黄素转化为虾青素 |
| Saccharomyces cerevisiae | 类胡萝卜素生物合成 | bkt | β-胡萝卜素酮化酶 | 催化 | 来源于雨生红球藻，将β-胡萝卜素转化为角黄素 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 氨基酸/能量代谢 | GDH1/GDH3 | NADP(H)依赖的谷氨酸脱氢酶 | 调控 | GDH1下调、GDH3上调与虾青素产量增加相关 |
| Xanthophyllomyces dendrorhous | 糖酵解 | GPDH | 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 | 催化 | 参与糖酵解，其表达变化与虾青素合成相关 |
关键发现
- X. dendrorhous 天然产生约 97% 非酯化 (3R,3'R)-虾青素；野生型产量为 200-400 μg/g 干重。随机突变株 Y119 产量达
- 4 mg/g 干重，JH1 产量>4 mg/g，M34 产量
- 5 mg/g；工程菌 AXJ-20/crtYB 产量>9.7 mg/g 干重。Pollmann 等通过敲低 crtI 并过表达 HMG1/crtE/crtYB 获得 phytoene 产量
- 5 mg/g 生物量，连续培养超过 10 mg/g。在 S. cerevisiae 中异源表达 crtYB/crtE/crtI 实现番茄红素产量 23 mg/g 干重，β-胡萝卜素产量
- 01 mg/g，通过表达 crtZ 和 bkt 实现虾青素产量
- 1 mg/g。CYP61 敲除使 HMG1 表达提高 2-5 倍，虾青素产量提高
- 4 倍。Mig1 表达下调使 crtYB 和 crtS 表达提高 2 倍。琥珀酸 (20 g/L) 代替葡萄糖使虾青素产量提高
- 5 倍。6-BAP 处理使生物量达
- 33 g/L，虾青素产量
- 67 mg/g 干重。
研究结论
通过代谢工程结合随机诱变、多组学分析和发酵优化，可显著提高 X. dendrorhous 的 (3R,3'R)-虾青素产量，但距离与化学合成竞争仍需进一步优化碳代谢流和解除瓶颈。