Bioprocess performance analysis of novel methanol-independent promoters for recombinant protein production with Pichia pastoris
- 作者
- Javier Garrigos-Martínez, Kiara Vuoristo, Miguel Angel Nieto-Taype, Juha Tähtiharju, Jaana Uusitalo, Pauliina Tukiainen, Christian Schmid, Ilya Tolstorukov, Knut Madden, Merja Penttilä, José Luis Montesinos-Seguí, Francisco Valero, Anton Glieder, Xavier Garcia-Ortega
- 单位
- Department of Chemical, Biological and Environmental Engineering, Universitat Autonoma de Barcelona; Solutions for Natural Resources and Environment, VTT Technical Research Centre of Finland Ltd; Keck Graduate Institute; Biogrammatics Inc; Institute of Molecular Biotechnology, Graz University of Technology; Bisy GmbH
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2021）
- DOI
- 10.1186/s12934-021-01564-9
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在毕赤酵母中，传统的甲醇诱导AOX1启动子存在安全与操作成本问题，而组成型GAP启动子产量有限，因此需要开发并表征新型甲醇非依赖启动子，以提升重组蛋白生产效率。
研究策略
以CalB为模型蛋白，构建仅启动子不同的等基因单拷贝克隆（GAP-C、PDF-C、UPP-C），通过恒化器培养系统研究不同稀释率下的生产动力学，结合转录水平分析和UPR基因表达监测，并在15 L补料分批反应器中验证最优条件。
核心内容
本研究以脂肪酶CalB为模型蛋白，在毕赤酵母中系统比较了新型甲醇非依赖启动子P_PDF和P_UPP与常用组成型启动子P_GAP的生产性能。通过构建仅启动子不同的等基因单拷贝菌株，结合恒化器培养、转录分析和UPR基因监测，首次深入揭示了三种启动子在宏观动力学上的差异。结果表明，P_PDF和P_UPP驱动的比生产速率较P_GAP高4至9倍，其中在稀释率0.10 h⁻¹时最高分别达10.8和12.9 AU gx⁻¹ h⁻¹，而GAP仅为2.24；在0.05 h⁻¹下UPP-C的产物得率较GAP-C提升8.7倍。补料分批放大实验中，低生长速率（0.05 h⁻¹）下PDF-C和UPP-C的滴度分别比中速条件高38%和67%，且恒化器结果可有效预示放大表现。研究证明P_PDF具有生长速率依赖的可调表达特性，P_UPP则为生长非依赖的强组成型启动子，两者均可作为替代P_GAP的高效表达工具，UPR响应程度与高产量密切相关。
创新点
首次对商业化的PDF和UPP启动子进行深入的宏观动力学比较；在恒化器培养中系统揭示其与GAP启动子在生产速率、转录水平、UPR响应上的差异；证明了不同启动子可实现表达水平的可调性；成功将恒化器结果放大到补料分批工艺。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia pastoris (Komagataella phaffii) | 重组蛋白生产 | CALB | CalB (Candida antarctica lipase B) | 催化 | 模型重组蛋白，检测其分泌活性与产量 |
| Pichia pastoris (Komagataella phaffii) | 甲醇非依赖表达系统 | P_GAP promoter | — | 调控 | 组成型甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子，作为参考对照 |
| Pichia pastoris (Komagataella phaffii) | 甲醇非依赖表达系统 | P_PDF promoter | — | 调控 | Hansenula polymorpha FMD启动子的商业化变体，去抑制调控，可被甲醇诱导 |
| Pichia pastoris (Komagataella phaffii) | 甲醇非依赖表达系统 | P_UPP promoter | — | 调控 | 毕赤酵母GCW14启动子的商业化变体，组成型强表达 |
| Pichia pastoris (Komagataella phaffii) | UPR应激响应 | HAC1 | Hac1 | 调控 | UPR主调控转录因子，其转录水平反映内质网应激 |
关键发现
- 在恒化器培养中，P_PDF和P_UPP驱动的CalB比生产速率(q_p)较P_GAP高4至9倍；最高q_p分别为PDF-C
- 8 AU gx-1 h-1、UPP-C
- 9 AU gx-1 h-1（D=0.10 h-1），而GAP-C仅为2.24 AU gx-1 h-1。UPP-C在D=0.05 h-1时Y_P/X*达217 AU gx-1，是GAP-C（24.9）的8.7倍。CALB转录水平最高可提升8倍以上。在补料分批培养中，低μ（0.05 h-1）下PDF-C和UPP-C的产品滴度分别比中μ高38%和67%；PDF-C在FB模式下的q_p平均比同等μ恒化器高24%，Y_P/X*高41%。
研究结论
新型甲醇非依赖启动子P_PDF和P_UPP在CalB生产中显著优于广泛使用的P_GAP，两者均可作为毕赤酵母重组蛋白生产的高效替代方案；P_PDF呈现生长速率依赖的可调表达，P_UPP为生长非依赖的强组成型表达，且UPR对高产量有显著影响。