A novel protein fusion partner, carbohydrate-binding module family 66, to enhance heterologous protein expression in Escherichia coli
- 作者
- Hyunjun Ko, Minsik Kang, Mi-Jin Kim, Jiyeon Yi, Jin Kang, Jung-Hoon Bae, Jung-Hoon Sohn, Bong Hyun Sung
- 单位
- Synthetic Biology and Bioengineering Research Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB); Department of Biosystems and Bioengineering, KRIBB School of Biotechnology, Korea University of Science and Technology (UST)
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2021）
- DOI
- 10.1186/s12934-021-01725-w
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
大肠杆菌中异源蛋白常形成包涵体，需要开发新型融合标签以提高目标蛋白的可溶性表达。
研究策略
开发基于碳水化合物结合模块家族66（CBM66）的新型融合标签，将CBM66与目标蛋白N端融合，利用其伴侣样作用提高可溶性表达，并利用levan-琼脂糖树脂实现融合蛋白的纯化。
核心内容
该研究开发了一种来源于Bacillus subtilis SacC蛋白的新型融合标签——碳水化合物结合模块家族66（CBM66），并将其与目标蛋白N端融合，在大肠杆菌BL21(DE3)中实现异源蛋白的可溶性表达。作者在七种难表达蛋白上验证了标签效果，包括四种人源蛋白EGF、VEGF、NOG、BMP7以及三种微生物酶CALB、ADH1、PETase，均获得显著可溶性产量，其中EGF为233 mg/L，PETase可溶产量达306 mg/L（总产量360 mg/L），平均可溶性比例超过81%。与商业标签MBP和GST相比，CBM66融合的PETase可溶表达量约370 mg/L，高出3.7倍。此外，利用levan-琼脂糖树脂对融合蛋白进行温和亲和纯化，经肠激酶切割后PETase回收率为88.6%，切割效率90.1%。活性检测显示，CBM66-PETase活性为商业酶的97.9%，CBM66-ADH1比活为305.4 U/mg，与商业酶相当。该标签兼具促溶和亲和纯化功能，为大肠杆菌体系中高价值蛋白的低成本生产提供了新工具。
创新点
首次将CBM66用作融合标签；在七个难表达蛋白上验证了可溶性增强效果；与商业标签MBP和GST相比，CBM66对PETase的可溶性表达产量高出3.7倍；开发了基于levan-琼脂糖的温和亲和纯化体系。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 异源蛋白表达 | cbm66 (BsSacC residues 514-677) | CBM66 | 调控 | 来自Bacillus subtilis的碳水化合物结合模块66，作为新型融合标签，显著提高目标蛋白可溶性表达，可用levan-琼脂糖纯化 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 异源蛋白表达 | EGF | EGF | 调控 | 人表皮生长因子，融合CBM66后可溶表达产量233 mg/L，可溶性比例80.1% |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 异源蛋白表达 | VEGF | VEGF | 调控 | 人血管内皮生长因子165，融合CBM66后可溶表达产量119 mg/L，可溶性比例85.1% |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 异源蛋白表达 | NOG | NOG | 调控 | 人Noggin蛋白，融合CBM66后可溶表达产量323 mg/L，首次在大肠杆菌中可溶表达 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 异源蛋白表达 | BMP7 | BMP7 | 调控 | 人骨形态发生蛋白7，融合CBM66后可溶表达产量279 mg/L，未融合时几乎不溶 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 异源蛋白表达 | calb | CALB | 催化 | 南极假丝酵母脂肪酶B，融合CBM66后可溶表达产量327 mg/L |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 异源蛋白表达 | ADH1 | ADH1 | 催化 | 酿酒酵母醇脱氢酶1，融合CBM66后可溶表达产量189 mg/L，可溶性比例53% |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 异源蛋白表达 | PETase | PETase | 催化 | 来自Ideonella sakaiensis的聚对苯二甲酸乙二醇酯水解酶，融合CBM66后可溶表达306 mg/L（总360 mg/L），可溶性85%；与MBP/GST相比可溶表达量高3.7倍 |
关键发现
CBM66标签显著提高了七种难表达蛋白的可溶性表达。人源蛋白EGF、VEGF、NOG、BMP7可溶产量分别为233、119、323、279 mg/L，平均可溶性比例超过81%。微生物酶CALB、ADH1、PETase的可溶产量分别为327、189、306 mg/L（PETase总产量360 mg/L，可溶性85%）。与MBP和GST相比，CBM66融合的PETase可溶表达量约370 mg/L，比商业标签高3.7倍。经肠激酶切割和levan-琼脂糖亲和层析，PETase回收率为88.6%，切割效率90.1%。融合蛋白保持了生物活性：CBM66-PETase活性为商业酶的97.9%，CBM66-EGF比活为1.8×10^6 EU/mg（为商业的97.6%），CBM66-ADH1比活为305.4 U/mg（商业为300.1 U/mg）。
研究结论
CBM66标签能够有效提高异源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达，并可通过levan-琼脂糖进行温和纯化，为高价值蛋白的经济生产提供了新工具。