Improving furfural tolerance in a xylose-fermenting yeast Spathaspora passalidarum CMUWF1-2 via adaptive laboratory evolution
- 作者
- Thanyalak Saengphing, Pachara Sattayawat, Thitisuda Kalawil, Nakarin Suwannarach, Jaturong Kumla, Mamoru Yamada, Watanalai Panbangred, Nadchanok Rodrussamee
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2024）
- DOI
- 10.1186/s12934-024-02352-x
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
Spathaspora passalidarum CMUWF1-2 能高效发酵木糖产乙醇，但对木质纤维素预处理和水解过程中释放的糠醛敏感，导致乙醇产量低下。需要通过进化工程提高其糠醛耐受性。
研究策略
以糠醛为唯一胁迫因子，采用适应性实验室进化（ALE）通过17轮连续传代培养，从1.0 g/L糠醛逐步提高至2.5 g/L，筛选获得耐受菌株AF2.5，并对其生长、木糖利用、乙醇生产、ROS积累和核染色质形态进行了表征。
核心内容
本研究以木糖发酵酵母Spathaspora passalidarum CMUWF1-2为对象，针对其糠醛耐受性差的问题，采用适应性实验室进化策略，以糠醛为唯一胁迫因子，通过17轮连续传代培养，将糠醛浓度从1.0 g/L逐步提升至2.5 g/L，最终获得耐受菌株AF2.5。该菌株可耐受高达4.0 g/L的糠醛，而野生型在超过3.0 g/L时完全受抑。在2.0 g/L糠醛存在下，AF2.5的延滞期较野生型缩短2倍（24小时对48小时），乙醇产率达0.145 g/L/h，比野生型提高1.48倍，且ROS积累减少3.41倍，核染色质扩散细胞比例显著降低。在3.0 g/L糠醛下，AF2.5能完全消耗木糖，最高乙醇产量达6.12 g/L，乙醇得率0.33 g/g，而野生型完全不能生长。此外，AF2.5还获得对乙醇和HMF的交叉耐受性，同时保持了亲本菌株耐高温、无葡萄糖抑制和同步利用糖类的特性。结果表明，以单一抑制剂为胁迫因子的ALE策略可有效提升工业酵母的抑制剂耐受性，并揭示了糠醛耐受性与氧化应激缓解和基因组稳定性之间的关联。
创新点
['首次使用单一胁迫因子糠醛对 S. passalidarum CMUWF1-2 进行适应性实验室进化，而非混合水解液胁迫', '获得的 AF2.5 菌株可耐受 4.0 g/L 糠醛，同时提高乙醇和 HMF 耐受性', '保持了亲本菌株的耐高温、无葡萄糖抑制和同步利用糖类的特性', '揭示了糠醛耐受性与延滞期缩短、ROS积累减少和核染色质扩散减少之间的关联']
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Spathaspora passalidarum CMUWF1-2 | 木糖发酵/乙醇发酵 | — | — | 催化 | 野生型菌株，耐热（42°C）、无葡萄糖抑制，能同时利用葡萄糖、木糖等糖类，对糠醛敏感 |
| Spathaspora passalidarum AF2.5 | 木糖发酵/乙醇发酵 | — | — | 催化 | 通过17轮ALE获得的糠醛耐受进化菌株，可耐受4.0 g/L糠醛，乙醇和HMF耐受性也提高 |
| — | 戊糖磷酸途径 | ZWF1 | 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 | 催化 | 讨论中推测与糠醛耐受相关，通过提供NADPH增强氧化应激保护 |
| — | 戊糖磷酸途径 | GND1 | 6-磷酸葡糖酸脱氢酶 | 催化 | 讨论中推测与糠醛耐受相关 |
| — | 戊糖磷酸途径 | RPE1 | 核酮糖-5-磷酸-3-差向异构酶 | 催化 | 讨论中推测与糠醛耐受相关 |
| — | 戊糖磷酸途径 | TKL1 | 转酮醇酶 | 催化 | 讨论中推测与糠醛耐受相关 |
| — | 糠醛/糠醇转化 | ADH1 | 醇脱氢酶 | 催化 | 讨论中提到在Candida tropicalis中敲除ADH1降低糠醛耐受性，涉及将糠醛还原为糠醇 |
| — | 氧化应激响应 | SOD1 | 超氧化物歧化酶 | 催化 | 讨论中提及乙醇胁迫下SOD1表达降低ROS |
| — | 脯氨酸转运 | PLT4 | 高亲和力脯氨酸转运蛋白 | 转运 | 讨论中提及脯氨酸摄取增加可降低ROS，保护酵母免受乙醇胁迫 |
关键发现
- ['AF2.5 经17轮（2715小时）ALE获得，能耐受高达4.0 g/L糠醛，而野生型在超过3.0 g/L时完全抑制', '在2.0 g/L糠醛存在下，AF2.5的延滞期比野生型短2倍（24小时后进入对数期，而野生型需48小时）', '在2.0 g/L糠醛下，AF2.5的ROS积累比CMUWF1-2少3.41倍；在70 mM H2O2下，野生型ROS是AF2.5的7.72倍', '在2.0 g/L糠醛下，AF2.5核染色质扩散细胞比例在24h和36h分别比野生型少1.41倍（62.86% vs
- 94%）和1.24倍（75.94% vs
- 04%）', '在3.0 g/L糠醛下，AF2.5可完全消耗木糖（96h），最高乙醇产量6.12±0.81 g/L，乙醇得率0.33±0.01 g/g（72h），野生型完全不能生长', '在2.0 g/L糠醛下，AF2.5乙醇产率0.145±0.003 g/L/h，比野生型提高1.48倍；最高乙醇浓度在48h达到6.98±0.14 g/L，野生型需72h', 'AF2.5能耐受7% (v/v)乙醇和2.5 g/L HMF，而野生型不能', '两种菌株对35% (w/v)葡萄糖和42°C的耐受水平相似；均无葡萄糖抑制', '无糠醛时，AF2.5和野生型最高乙醇产量相近（8.01 vs
- 18 g/L）']
研究结论
通过以糠醛为单一胁迫因子的适应性实验室进化，成功获得糠醛耐受菌株 S. passalidarum AF2.5，其不仅糠醛耐受性显著提高（可耐受4.0 g/L），还获得了更高的乙醇和HMF耐受性，同时保持原有的耐热性、无葡萄糖抑制和同步糖利用能力。在糠醛存在下，AF2.5较野生型表现更短的延滞期、更高的乙醇生产速率和产量，且ROS积累和核染色质扩散减少，证明ALE是改善工业酵母菌株抑制剂耐受性的有效策略。