Genetic engineering of Nannochloropsis oceanica to produce canthaxanthin and ketocarotenoids
- 作者
- Davide Canini, Flavio Martini, Stefano Cazzaniga, Tea Miotti, Beatrice Pacenza, Sarah D'Adamo, Matteo Ballottari
- 单位
- Dipartimento di Biotecnologie, Universita Degli Studi di Verona, Strada le Grazie 15, 37134 Verona, Italy; Bioprocess Engineering Chair Group, Wageningen University and Research, Wageningen 6700 AA, The Netherlands
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2024）
- DOI
- 10.1186/s12934-024-02599-4
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
海洋微藻 Nannochloropsis oceanica 天然积累酮类胡萝卜素（尤其是角黄素）含量极低，难以满足工业需求，缺乏高效的异源合成策略。
研究策略
从莱茵衣藻获得经截短和密码子优化的 β-胡萝卜素酮醇化酶基因 CrBKT，以 LP-tdTomato 着陆垫菌株为底盘，通过同源重组将 CrBKT 整合到高转录核糖体 DNA 位点，利用负荧光筛选高效获得转化株；随后在不同光照强度和营养条件下评估生长、光合性能及酮类胡萝卜素/角黄素产量。
核心内容
该研究通过合成生物学手段对海洋微藻Nannochloropsis oceanica进行遗传改造，以实现酮类胡萝卜素尤其是角黄素的高效生产。研究者从莱茵衣藻获取经截短和密码子优化的β-胡萝卜素酮醇化酶基因CrBKT，借助LP-tdTomato着陆垫菌株，通过同源重组将其整合至高转录核糖体DNA位点，并利用负荧光筛选高效获得转化株。结果显示，异源表达CrBKT后，类胡萝卜素和酮类胡萝卜素含量分别提高1.5倍和10倍，酮类胡萝卜素占总类胡萝卜素的50%，其中角黄素占26%，最高产量分别可达干重的0.3%和0.2%，角黄素滴度达1.5–1.6 mg/L。研究发现内源β-胡萝卜素羟化酶活性不足限制了虾青素合成，使角黄素成为主要累积产物。bkt工程株在高光下表现出增强的光合性能和耐受性。该策略无需胁迫条件即可实现角黄素的稳定积累，为以CO₂为唯一碳源生产饲料色素添加剂提供了可行的工业途径。
创新点
['利用 LP-tdTomato 着陆垫菌株通过同源重组将密码子优化的截短 CrBKT 整合到高转录位点，并用负荧光筛选实现高效、简便的转化株筛选。', '在 N. oceanica 中实现酮类胡萝卜素占总类胡萝卜素约 50%、角黄素占 26%，无需胁迫即可稳定积累。', '揭示内源 β-胡萝卜素羟化酶活性不足是虾青素合成的限速步骤，使角黄素成为主要累积产物。', '发现 bkt 转化株在高光下具有更高的 PSII 电子传递速率、更低的 NPQ 和更高的最大生物量生产率，表现出增强的高光耐受性。']
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Nannochloropsis oceanica (LP-tdTomato 背景菌株) | 类胡萝卜素生物合成途径（β-胡萝卜素→角黄素→虾青素） | CrBKT（来自 Chlamydomonas reinhardtii，密码子优化并截短，编码 328 aa） | β-胡萝卜素酮醇化酶 CrBKT | 催化 | 将 β-胡萝卜素酮醇化为角黄素，也可作用于玉米黄质；转化株包括 bkt2、bkt3、bktA2、bktA5 |
| Nannochloropsis oceanica | 叶绿体蛋白靶向导入 | VCP1 叶绿体靶向肽 cTP | cTP（chloroplast target peptide） | 区室化 | 引导 CrBKT 蛋白定位至叶绿体，提高异源表达效率 |
| Nannochloropsis oceanica | 类胡萝卜素生物合成途径 | NoCYP97F5 | 细胞色素 P450 型 β-胡萝卜素羟化酶 | 催化 | 内源羟化酶活性低，是将角黄素进一步转化为虾青素的限速步骤，导致角黄素积累 |
关键发现
- 通过异源表达 CrBKT，类胡萝卜素和酮类胡萝卜素含量（每细胞）分别提高
- 5 倍和 10 倍；酮类胡萝卜素占总类胡萝卜素的 50%，其中角黄素占 26%；在 150 µmol m⁻² s⁻¹ 下培养获得最高产量，酮类胡萝卜素和角黄素最高分别可达干重的
- 3% 和
- 2%，角黄素以 CO₂ 为唯一碳源时滴度为
- 5-1.6 mg/L；酮类胡萝卜素和角黄素最高生产率分别为
- 32 mg L⁻¹ d⁻¹ 和
- 17 mg L⁻¹ d⁻¹（背景株 LP 分别为
- 08 和
- 02 mg L⁻¹ d⁻¹）；生长过程中第 4 天酮类胡萝卜素生产率峰值达
- 6 mg L⁻¹ d⁻¹，第 5 天角黄素生产率峰值达
- 3 mg L⁻¹ d⁻¹；bkt 株叶绿素/类胡萝卜素比值由
- 91 降至
- 26；在 1200 µmol m⁻² s⁻¹ 下 bkt 株最大生物量生产率约
- 6 g L⁻¹ d⁻¹，高于 LP 的
- 2 g L⁻¹ d⁻¹。
研究结论
通过异源表达优化的 CrBKT，成功将 N. oceanica 的代谢流转向酮类胡萝卜素合成，角黄素含量可达干重 0.2%，总酮类胡萝卜素可达干重 0.3%，且无需胁迫条件。内源羟化酶活性不足限制了虾青素积累，使角黄素成为主要产物。该 bkt 工程株在鱼类和家禽饲料色素添加剂领域具有工业应用潜力，并可利用 CO₂ 作为唯一碳源生产角黄素。