De novo production of bioactive sesterterpenoid ophiobolins in Saccharomyces cerevisiae cell factories
- 作者
- Caizhe Zhang, Jun Wu, Qing Sun, Shuaishuai Ding, Hua Tao, Yuhua He, Hui Qiu, Bei Shu, Dongqing Zhu, Hengcheng Zhu, Kui Hong
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2024）
- DOI
- 10.1186/s12934-024-02406-0
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
实现生物活性蛇孢菌素（ophiobolins）在酿酒酵母中的高效异源从头合成，克服前体供给不足、P450酶表达困难和产物毒性等问题。
研究策略
结合全细胞生物转化与系统代谢工程：增强MVA途径和前体（乙酰-CoA、NADPH）供给，优化P450-CPR系统，并通过PDR工程促进产物外排。
核心内容
本研究在酿酒酵母中构建了蛇孢菌素类萜化合物的从头合成细胞工厂。通过增强甲羟戊酸途径以增加前体乙酰-CoA和NADPH供给，引入蛇孢菌素骨架合酶ObIA，并结合全细胞生物转化策略，使骨架产物OphF的产量从初始7.5 mg/L逐步提升至661.3 mg/L，在补料分批全细胞转化利用乙醇和油酸条件下最高达到5.1 g/L，较此前报道的最高150 mg/L提高约33倍。通过筛选获得最适P450酶BmobIB，并引入异源CPR Au779CPR使后续氧化产物产量提高40%；过表达外排泵基因PDR5使OphU产量达到128.9 mg/L，产物外排比例从81.9%提升至91.4%。此外，研究还发现一种新型强细胞毒性化合物5-羟基-21-甲酰基蛇孢菌素F，其对A2780、Siha和MDA-MB-231细胞系的IC50分别为1.33、4.64和10.71 μM。该工作首次在酿酒酵母中实现了蛇孢菌素骨架及其氧化衍生物的从头合成，为复杂萜类化合物的微生物制造提供了可行范式。
创新点
首次在酿酒酵母中实现蛇孢菌素骨架从头合成；全细胞转化结合代谢工程使OphF产量达5.1 g/L（为已报道最高）；发现新型强细胞毒性化合物5-羟基-21-甲酰基蛇孢菌素F；通过PDR工程将OphU产量提升至128.9 mg/L。
研究对象（20）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | MVA途径 | GAL80 | Gal80p | 调控 | 敲除以实现GAL启动子的葡萄糖调控 |
| Saccharomyces cerevisiae | 蛇孢菌素生物合成 | AuobIA (AaobIA) | ObIA | 催化 | 双功能萜合酶，负责GFPP合成与环化 |
| Saccharomyces cerevisiae | MVA途径 | tHMG1 | 截短HMG-CoA还原酶 | 催化 | 限速酶，截短增强活性 |
| Saccharomyces cerevisiae | MVA途径 | ERG10 | 乙酰-CoA乙酰转移酶 | 催化 | 过表达增强前体供给 |
| Saccharomyces cerevisiae | MVA途径 | ERG13 | HMG-CoA合酶 | 催化 | 过表达增强前体供给 |
| Saccharomyces cerevisiae | MVA途径 | ERG12 | 甲羟戊酸激酶 | 催化 | 过表达增强前体供给 |
| Saccharomyces cerevisiae | MVA途径 | ERG8 | 磷酸甲羟戊酸激酶 | 催化 | 过表达增强前体供给 |
| Saccharomyces cerevisiae | MVA途径 | MVD1 | 甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶 | 催化 | 过表达增强前体供给 |
| Saccharomyces cerevisiae | MVA途径 | IDI1 | 异戊烯基二磷酸异构酶 | 催化 | 过表达增强前体供给 |
| Saccharomyces cerevisiae | MVA途径 | ERG20 | 法尼基焦磷酸合酶 | 催化 | 过表达增强前体供给 |
| Saccharomyces cerevisiae | 蛇孢菌素生物合成 | BmobIB | 细胞色素P450酶 | 催化 | 氧化OphF生成5-OH-21-CHO-OphF和OphU |
| Saccharomyces cerevisiae | 蛇孢菌素生物合成 | CPR (Au779CPR) | 细胞色素P450还原酶 | 催化 | 异源CPR，提供电子，提高P450催化效率 |
| Saccharomyces cerevisiae | 蛇孢菌素生物合成 | AuoblC | FAD依赖氧化还原酶 | 催化 | 催化C16-C17脱氢生成OphU |
| Saccharomyces cerevisiae | 辅因子供给 | POS5 (tPOS5) | NADH激酶 | 能量供给 | 截短定位到胞质，提高NADPH供给 |
| Saccharomyces cerevisiae | 乙醇代谢 | ADH2 | 乙醇脱氢酶 | 催化 | 促进乙醇转化为乙酰-CoA |
| Saccharomyces cerevisiae | 乙酰-CoA合成 | ALD6 | 乙醛脱氢酶（NADP依赖） | 催化 | 过表达增强乙酰-CoA合成 |
| Saccharomyces cerevisiae | 乙酰-CoA合成 | ACS1 | 乙酰-CoA合成酶 | 催化 | 过表达增强乙酰-CoA合成 |
| Saccharomyces cerevisiae | 过氧化物酶体β-氧化 | Cat2 | 肉碱乙酰转移酶 | 区室化 | 锚定过氧化物酶体表面，增强胞质乙酰-CoA供应 |
| Saccharomyces cerevisiae | PDR网络 | PDR5 | ABC转运蛋白 | 转运 | 过表达促进OphU外排，产量提高至128.9 mg/L |
| Saccharomyces cerevisiae | PDR网络 | PDR1 | 转录因子 | 调控 | 调控PDR基因表达，增强耐药性 |
关键发现
- 通过增强MVA途径和全细胞转化，OphF产量从7.5 mg/L逐步提升至661.3 mg/L（Yoph16），补料分批全细胞转化利用乙醇和油酸后最高达5.1 g/L，较报道的最高150 mg/L提高33倍
- 过表达tPOS5、ADH2/ALD6/ACS1分别使OphF产量达649.6 mg/L和742.3 mg/L
- 利用油酸底物时OphF产量为178 mg/L
- 筛选获得最适P450酶BmobIB，异源CPR Au779CPR使后续氧化产物产量提高40%
- 过表达PDR5使OphU产量达128.9 mg/L，产物外排比例从81.9%提高到91.4%
- 新化合物5-OH-21-CHO-OphF对A2780、Siha、MDA-MB-231的IC50分别为1.33、4.64、10.71 μM，OphU对A2780的IC50为11.73 μM。
研究结论
本研究建立了基于酿酒酵母的细胞工厂，实现了蛇孢菌素骨架OphF及氧化衍生物的从头合成，通过全细胞转化和代谢工程获得5.1 g/L OphF，通过优化CPR和PDR基因获得128.9 mg/L OphU，并发现强活性新化合物5-OH-21-CHO-OphF，为复杂萜类化合物的合成提供了范式。