Mapping competitive pathways to terpenoid biosynthesis in Synechocystis sp. PCC 6803 using an antisense RNA synthetic tool
- 作者
- João S. Rodrigues, Barbara Bourgade, Karen R. Galle, Pia Lindberg
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2023）
- DOI
- 10.1186/s12934-023-02040-2
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
蓝藻中萜类生物合成途径碳通量低，需要识别并下调与目标萜类生产竞争的代谢通路，以提高异源萜类（异戊二烯、红没药烯）的产量。
研究策略
利用基于Hfq-MicC的反义RNA合成工具，在镍诱导启动子PnrsB控制下，靶向12个与萜类生物合成、中心碳代谢、氨基酸生物合成及ATP产生相关的基因进行基因敲低，以异戊二烯和红没药烯为报告分子评价敲低效果，并通过RT-qPCR验证敲低效率。
核心内容
本研究在集胞藻PCC 6803中利用基于Hfq-MicC的反义RNA合成工具，系统扫描并敲低了12个与萜类生物合成、中心碳代谢、氨基酸合成及ATP产生相关的竞争性通路基因，以异戊二烯和红没药烯为报告分子评估敲低效果。在镍诱导启动子PnrsB控制下，RT-qPCR验证显示chlP和sqs在无诱导时转录水平分别降低20%和30%，诱导后约降低50%，crtE和crtB诱导后分别降低20%和30%。结果鉴定出crtE、chlP、thiG、ilvG、ccmA、gpi六个基因敲低可显著提高异戊二烯产量，chlP和crtB敲低使红没药烯累积产量增加20%。研究首次系统性地将Hfq-MicC反义RNA工具应用于蓝藻竞争性代谢通路扫描，证实敲低叶绿素a和类胡萝卜素合成通路对长链萜烯生产具有积极效果，为蓝藻萜类代谢工程提供了crtE、chlP等潜在靶点，尽管Hfq表达本身对细胞存在一定毒性。
创新点
首次系统性地利用Hfq-MicC反义RNA工具在Synechocystis sp. PCC 6803中扫描竞争性代谢通路；鉴定出6个能提高异戊二烯产量的基因靶点（crtE、chlP、thiG、ilvG、ccmA、gpi）及2个能提高红没药烯产量的基因靶点（chlP、crtB）；发现敲低叶绿素a和类胡萝卜素合成通路对长链萜烯生产具有积极效果。
研究对象（17）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 萜类生物合成（MEP途径下游） | crtE | 聚异戊二烯转移酶 | 催化 | 催化IPP与DMAPP缩合生成GPP、FPP和GGPP，敲低后提高异戊二烯产量 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 叶绿素a生物合成 | chlP | 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸还原酶（GGPP还原酶） | 催化 | 催化GGPP还原为植基焦磷酸，敲低后提高异戊二烯和红没药烯产量 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 类胡萝卜素生物合成 | crtB | 八氢番茄红素合酶 | 催化 | 催化两分子GGPP缩合生成八氢番茄红素，敲低后对异戊二烯无显著影响，但提高红没药烯产量 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | hopanoid生物合成 | sqs | 角鲨烯合酶 | 催化 | 催化两分子FPP缩合生成角鲨烯，敲低后对异戊二烯和红没药烯产量无显著影响 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 维生素B1（硫胺素）生物合成 | thiG | 硫胺素合酶（噻唑合酶） | 催化 | 催化MEP途径中间体DXP进入硫胺素合成分支，敲低后提高异戊二烯产量 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 糖代谢（糖酵解/糖异生） | gpi | 葡萄糖6-磷酸异构酶 | 催化 | 催化果糖6-磷酸与葡萄糖6-磷酸互变，敲低后提高异戊二烯产量 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 中心碳代谢（TCA回补） | pepc | 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 | 催化 | 催化PEP羧化生成草酰乙酸，敲低后对异戊二烯产量无显著影响 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 乳酸发酵 | ddh | D-乳酸脱氢酶 | 催化 | 催化丙酮酸还原为D-乳酸，敲低后对异戊二烯产量无显著影响 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 支链氨基酸生物合成 | ilvB | 乙酰乳酸合酶催化亚基（IIvB） | 催化 | 催化两分子丙酮酸缩合为乙酰乳酸，敲低后对异戊二烯产量无显著影响 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 支链氨基酸生物合成 | ilvG | 乙酰乳酸合酶催化亚基（IIvG） | 催化 | 催化两分子丙酮酸缩合为乙酰乳酸，敲低后提高异戊二烯产量 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 芳香族氨基酸生物合成（莽草酸途径） | ccmA | 3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合酶（DAHP合酶） | 催化 | 催化PEP与E4P缩合生成DAHP，敲低后提高异戊二烯产量 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | ATP合成（能量代谢） | atpB | ATP合酶β亚基 | 能量供给 | ATP合酶催化亚基，敲低对异戊二烯产量无显著影响 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | MEP途径（异源表达） | dxs | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（来自Plectranthus barbatus/Coleus forskohlii） | 催化 | 催化丙酮酸和G3P缩合生成DXP，过表达以增强萜类前体供给 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | MEP途径（异源表达） | idi | 异戊烯基焦磷酸异构酶（IDI） | 催化 | 催化IPP与DMAPP互变，过表达以改善前体比例 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 异戊二烯合成（异源表达） | EglspS | 异戊二烯合酶（来自Eucalyptus globulus） | 催化 | 催化DMAPP生成异戊二烯，作为报告分子 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 红没药烯合成（异源表达） | AgB | 红没药烯合酶（来自Abies grandis） | 催化 | 催化FPP生成红没药烯，作为报告分子 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | RNA调控（异源表达） | hfq | Hfq伴侣蛋白（来自E. coli） | 调控 | 结合反义RNA促进其与靶mRNA配对并介导降解，在镍诱导启动子PnrsB控制下表达 |
关键发现
- 在异戊二烯生产中，crtE、chlP、thiG、ilvG、ccmA和gpi基因敲低后，诱导条件下异戊二烯产量（每细胞）显著高于对照
- 5 μM NiCl2足以激活Hfq-MicC系统，5 μM NiCl2导致生长抑制
- RT-qPCR显示，chlP和sqs在无诱导时转录水平分别降低20%和30%，诱导后约降低50%
- crtE和crtB诱导后转录水平分别降低20%和30%。在红没药烯生产中，诱导BIS_chIP和BIS_crtB菌株后8天累积产量增加20%。
研究结论
Hfq-MicC反义RNA工具可用于Synechocystis中基因敲低效果的评估，尽管Hfq表达本身对细胞存在一定毒性。本研究确定了多个有潜力的基因工程靶点，包括crtE、chlP、thiG、ilvG、ccmA、gpi（异戊二烯）以及chlP、crtB（红没药烯），为后续蓝藻萜类代谢工程提供了方向。