Bidirectional hybrid erythritol-inducible promoter for synthetic biology in Yarrowia lipolytica
- 作者
- Lea Vidal, Esteban Lebrun, Young-Kyoung Park, Guillaume Mottet, Jean-Marc Nicaud
- 单位
- UMR1319, Team BMLip: Integrative Biology of Microbial Lipid Metabolism, Université Paris-Saclay, INRAE, AgroParisTech, Macias Institute, Domaine de Villeret, 78350 Jouy-en-Josas, France; Large Molecules Research, Sanofi, 94400 Vitry-Sur-Seine, France
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2023）
- DOI
- 10.1186/s12934-023-02020-6
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
缺乏可诱导的双向启动子用于Yarrowia lipolytica中两个基因的协同表达，限制了合成生物学和代谢工程的应用。
研究策略
基于已鉴定的赤藓糖醇诱导型启动子pEYK，利用其EYK1-EYL1基因间区域（pEYK450）构建天然双向启动子，并通过融合PCR插入5拷贝UAS1-eyk1构建杂合双向启动子（pEYK450-5AB），使用YFP和RedStarII荧光报告基因表征双向表达强度，并在微生物反应器中优化培养条件。
核心内容
该研究针对解脂耶氏酵母中缺乏可诱导双向启动子的瓶颈，基于赤藓糖醇诱导型启动子pEYK的EYK1-EYL1基因间区域构建了天然双向启动子pEYK450，并通过融合PCR插入5拷贝UAS1-eyk1增强子，获得杂合双向启动子pEYK450-5AB。以YFP和RedStarII为报告基因表征双向表达强度，结果显示pEYK450在EYL1方向的转录强度比EYK1方向高2.7至3.5倍；杂合启动子pEYK450-5AB的表达水平比天然启动子高8.6至19.2倍，且分别达到强组成型启动子pTEF的5.0倍（EYL1方向）和2.4倍（EYK1方向）。在微反应器优化中，10 g/L甘油诱导时荧光产量最高，比10和25 g/L葡萄糖分别高2.0倍和1.3倍；高渗条件下最大荧光降低50%，表明赤藓糖醇诱导对渗透压敏感。研究还开发了Golden Gate组装生物砖和专用载体GGE449，为双基因共表达提供了可精细调控的工具，拓展了该酵母在异源蛋白生产和代谢工程中的应用潜力。
创新点
首次在Yarrowia lipolytica中鉴定并工程化了赤藓糖醇诱导的双向启动子；构建了含5拷贝UAS1-eyk1的杂合双向启动子，显著提高双向表达强度；开发了新的Golden Gate组装生物砖和专用目的载体GGE449，简化了双向启动子的使用。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Yarrowia lipolytica | 赤藓糖醇分解代谢 | EYK1 | 赤藓酮糖激酶 (Erythrulose kinase) | 催化 | 编码赤藓酮糖激酶，催化赤藓酮糖磷酸化 |
| Yarrowia lipolytica | 赤藓糖醇分解代谢 | EYL1 | D-赤藓酮糖-4-磷酸异构酶 (D-erythrulose-4-phosphate isomerase) | 催化 | 编码D-赤藓酮糖-4-磷酸异构酶 |
| Yarrowia lipolytica | 赤藓糖醇分解代谢 | EYD1 | 赤藓糖醇脱氢酶 (Erythritol dehydrogenase) | 催化 | 编码赤藓糖醇脱氢酶，催化赤藓糖醇氧化 |
| Yarrowia lipolytica | 赤藓糖醇分解代谢 | EYL2 | L-赤藓酮糖-1-磷酸异构酶 (L-erythrulose-1-phosphate isomerase) | 催化 | 编码L-赤藓酮糖-1-磷酸异构酶 |
| Yarrowia lipolytica | 赤藓糖醇分解代谢 | EUF1 | 转录因子 (Transcription factor) | 调控 | 参与赤藓糖醇利用的转录调控 |
| Yarrowia lipolytica | 启动子调控 | pEYK450 | — | 调控 | 天然双向启动子，位于EYK1-EYL1基因间区域，双向可控表达 |
| Yarrowia lipolytica | 启动子调控 | pEYK450-5AB | — | 调控 | 杂合双向启动子，含5拷贝UAS1-eyk1，表达强度大幅提高 |
关键发现
- pEYK450在EYL1方向转录强度比EYK1方向高2.7倍（YFP）和3.5倍（RedStarII）
- 杂合启动子pEYK450-5AB比天然双向启动子pEYK450表达水平高8.6-19.2倍（EYK1方向12.2倍YFP和19.2倍RedStarII，EYL1方向8.6倍YFP和10.8倍RedStarII）
- pEYK450-5AB比强组成型启动子pTEF高5.0倍（EYL1方向）和2.4倍（EYK1方向），而天然pEYK450比pTEF低约2倍
- 在微反应器中，JMY8833菌株在50 g/L葡萄糖和80 g/L甘油时达到最大细胞密度，10 g/L甘油时荧光产量最高，比10和25 g/L葡萄糖分别高2.0倍和1.3倍
- 渗透压测试表明，添加250 g/L山梨醇对荧光蛋白比生产速率无显著影响，但高渗条件下最大荧光降低，在G40S处理中荧光比G40高100%。
研究结论
本研究开发了表达可精细调控的赤藓糖醇诱导型双向和杂合双向启动子，可用于Yarrowia lipolytica中两个目标基因的共表达，为异源蛋白生产、代谢工程和合成生物学提供了有效工具。