Ethanol tolerance of Clostridium thermocellum: the role of chaotropicity, temperature and pathway thermodynamics on growth and fermentative capacity
- 作者
- Teun Kuil, Johannes Yayo, Johanna Pechan, Jan Kuchler, Antonius J. A. van Maris
- 单位
- Department of Industrial Biotechnology, School of Engineering Sciences in Chemistry, Biotechnology and Health, KTH Royal Institute of Technology, Stockholm, Sweden; Max Plank Institute for Dynamics of Complex Technical Systems, Otto-Von-Guericke-University Magdeburg, Magdeburg, Germany
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2022）
- DOI
- 10.1186/s12934-022-01999-8
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
Clostridium thermocellum的乙醇耐受性低，是限制其工业化生产纤维乙醇的主要障碍。乙醇抑制可能源于末端产物抑制和/或离液效应，但两者相对贡献尚不明确；同时需要探索降低培养温度是否可缓解乙醇诱导的应激。
研究策略
构建不产乙醇的突变菌株AVM062（过表达ldh并敲除adhE），以区分乙醇的离液效应与热力学/末端产物抑制效应；在45、50、55 °C下，对外源添加0-50 g/L乙醇的野生型DSM1313和突变株进行生长与产物表征；并通过硫限制培养基使细胞生长停滞，测定不同温度下添加乙醇后的发酵能力（生物量特异性纤维二糖发酵速率）。
核心内容
该研究以热纤梭菌为对象，探究其乙醇耐受性低的机制，旨在区分乙醇的离液效应与末端产物抑制效应，并评估降温缓解胁迫的可行性。作者构建了不产乙醇的突变株AVM062（过表达ldh并敲除adhE），在45、50、55 °C下对野生型和突变株施加0–50 g/L外源乙醇，比较生长和产物特征，同时利用硫限制培养基使细胞停滞以测定发酵能力。结果显示，AVM062的乙醇产量低于0.01 mol/mol纤维二糖，乳酸产量达1.63 mol/mol，而野生型仅0.18 mol/mol；在50和55 °C下，突变株在乙醇≥10 g/L时生长显著快于野生型。野生型在45和50 °C下于乙醇≥15 g/L时的最大OD600和相对生长速率高于55 °C，且停滞细胞在40 g/L乙醇下发酵能力更持久。降温仅对野生型有改善作用，说明该效应与内源乙醇合成途径及氧化还原平衡相关。敲除adhE可解除末端产物抑制，显著提升乙醇耐受性，该非产乙醇菌株为解析乙醇毒性机制提供了有效平台。
创新点
首次将乙醇的离液效应与末端产物热力学抑制在C. thermocellum中分离；构建了非产乙醇的平台菌株AVM062（Pclo1313_2638::ldh* ΔadhE），其乙醇耐受性显著高于野生型；系统证明降低培养温度可改善野生型C. thermocellum在乙醇胁迫下的生长和生长停滞细胞的发酵能力，且该改善与乙醇合成途径和氧化还原辅因子平衡有关。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Clostridium thermocellum DSM1313（野生型） | 乙醇发酵通路（糖酵解末端产物生成） | adhE (clo1313_1798) | AdhE（双功能乙醛/乙醇脱氢酶） | 催化 | 负责将乙酰辅酶A转化为乙醇，是乙醇生成的主要（可能唯一）途径；敲除该基因可完全消除乙醇生成。 |
| Clostridium thermocellum AVM062（Pclo1313_2638::ldh* ΔadhE） | 乳酸发酵通路 | ldh | Ldh（乳酸脱氢酶） | 催化 | 在强组成型启动子clo1313_2638后过表达，乳酸脱氢酶活性提高约50倍，乳酸产量提高9倍，用于补偿adhE缺失后的氧化还原平衡。 |
关键发现
突变株AVM062的乙醇产量低于0.01 mol/mol纤维二糖，乳酸产量达1.63 mol/mol纤维二糖（野生型为0.18 mol/mol），乳酸脱氢酶活性为30.46 μmol mg⁻¹ min⁻¹（野生型为0.57），最大比生长速率0.24 h⁻¹（野生型0.35 h⁻¹）。在50和55 °C下，AVM062在添加乙醇≥10 g/L时比野生型生长更快，且在45、50、55 °C所有乙醇浓度下达到更高最大OD600。野生型在45和50 °C下、乙醇≥15 g/L时的最大OD600和相对生长速率高于55 °C。生长停滞的野生型细胞在45和50 °C下、乙醇浓度达40 g/L时，其发酵能力随时间优于55 °C。野生型在无滞后情况下可生长至30 g/L外源乙醇，在35 g/L时仅于40 h后开始生长（50和55 °C）。
研究结论
降低培养温度可提高野生型C. thermocellum在乙醇胁迫下的相对生长速率、最大OD600及生长停滞细胞的发酵能力，但该正效应在非产乙醇突变株中未观察到，说明温度缓解的离液应激与野生型乙醇合成途径和氧化还原辅因子平衡相关。敲除adhE可解除末端产物抑制，显著提高乙醇耐受性。非产乙醇菌株是研究乙醇毒性的热力学与离液效应的有价值平台菌株。