Increasing cellular fitness and product yields in Pseudomonas putida through an engineered phosphoketolase shunt
- 作者
- Lyon Bruinsma, Maria Martin-Pascual, Kesi Kurnia, Marieken Tack, Simon Hendriks, Richard van Kranenburg, Vitor A. P. Martins dos Santos
- 单位
- Laboratory of Systems and Synthetic Biology, Wageningen University & Research, 6708 WE Wageningen, The Netherlands; Corbion, 4206 AC Gorinchem, The Netherlands; Laboratory of Microbiology, Wageningen University & Research, 6708 WE Wageningen, The Netherlands; Laboratory Bioprocess Engineering, Wageningen University & Research, 6708 WE Wageningen, The Netherlands; LifeGlimmer GmbH, 12163 Berlin, Germany; Faculty of Engineering and Natural Sciences, Tampere University, 33100 Tampere, Finland
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2023）
- DOI
- 10.1186/s12934-022-02015-9
- 所属领域
- 代谢工程
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解决的核心问题
恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）在以糖酵解碳源（如甘油和木糖）生长时，通过丙酮酸脱羧生成乙酰辅酶A的过程会造成碳以CO2形式损失，导致产物-底物收率偏低。核心问题是减少碳损失，提高细胞适应性和产物收率。
研究策略
在P. putida中引入磷酸转酮酶（phosphoketolase, Xfpk）支路，绕过丙酮酸脱羧，将果糖-6-磷酸（F6P）和木酮糖-5-磷酸（X5P）直接裂解为乙酰磷酸并转化为乙酰辅酶A，从而实现碳保守。筛选高活性Xfpk酶，并分别利用甘油和工程化木糖代谢路径验证效果。
核心内容
本研究在恶臭假单胞菌中引入来自短双歧杆菌的磷酸转酮酶（Xfpk）支路，将果糖-6-磷酸和木酮糖-5-磷酸直接裂解为乙酰磷酸，绕过丙酮酸脱羧步骤以减少碳以CO2形式的损失。研究者系统筛选了不同来源的Xfpk酶，发现短双歧杆菌来源的酶活性最高，产生36.25 mM乙酰磷酸/OD600，约为其他候选酶的30倍。在甘油为碳源时，过表达Xfpk使比生长速率从0.12 h⁻¹提高到0.18 h⁻¹，最大OD600从4.4提升至6.6；在木糖为碳源时，整合xylABE-xfpk的菌株比生长速率提高167%。产物收率方面，甘油条件下黄酮和甲羟戊酸收率分别提高38.5%和25.9%，木糖条件下分别提高49.4%和48.7%。结果表明，Xfpk支路有效减少了丙酮酸脱羧通量，增强了碳保守性，显著改善了细胞生长和乙酰辅酶A衍生化合物的生产，为在恶臭假单胞菌中全面实施碳守恒途径如非氧化糖酵解或GATCHYC循环奠定了基础。
创新点
首次在P. putida中系统筛选并引入来自Bifidobacterium breve的高活性Xfpk酶（活性约为其他候选的30倍）；通过该支路显著提高了细胞生长速率、生物量以及乙酰辅酶A衍生化合物（甲羟戊酸、丙二酰辅酶A/黄酮）的收率；为后续完整实施非氧化糖酵解（NOG）或GATCHYC循环提供了基础。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pseudomonas putida KT2440 (ΔglpR) | 磷酸转酮酶支路 / 甘油代谢 | xfpk (来自Bifidobacterium breve) | 磷酸转酮酶 (Xfpk) | 催化 | 裂解F6P生成乙酰磷酸，绕过丙酮酸脱羧；在甘油上提高生长速率44.3%和OD600 50% |
| Pseudomonas putida KT2440 (Δgcd) | 木糖代谢 / 磷酸转酮酶支路 | xfpk (来自Bifidobacterium breve) | 磷酸转酮酶 (Xfpk) | 催化 | 裂解X5P和F6P，在木糖上提高生长速率167%和OD600 30.2% |
| Pseudomonas putida KT2440 | 乙酰辅酶A代谢 / 丙二酰辅酶A生物合成 | rppA | III型聚酮合酶 (RppA) | 催化 | 将5个丙二酰辅酶A转化为1,3,6,8-四羟基萘，非酶氧化为黄酮，作为丙二酰辅酶A水平检测报告 |
| Pseudomonas putida KT2440 | 甲羟戊酸生物合成 | mvaE, mvaS | 乙酰辅酶A乙酰转移酶/HMG-CoA还原酶（mvaE双功能蛋白）和HMG-CoA合酶（mvaS） | 催化 | 从乙酰辅酶A合成甲羟戊酸，用于检测磷酸转酮酶支路对乙酰辅酶A衍生产物的增产效果 |
| Pseudomonas putida KT2440 | 木糖利用途径 | xylA, xylB, xylE | 木糖异构酶 (XylA)、木酮糖激酶 (XylB)、木糖H+共转运体 (XylE) | 催化 | xylA和xylB催化木糖转化为木酮糖-5-磷酸，xylE负责木糖转运；三者与xfpk共表达于木糖利用实验 |
| Pseudomonas putida KT2440 | 甘油代谢调控 | glpR | 甘油阻遏蛋白 (GlpR) | 调控 | 敲除glpR以避免甘油培养时的不稳定延滞期，用于甘油代谢研究 |
| Pseudomonas putida KT2440 | 糖代谢（葡萄糖脱氢） | gcd | 葡萄糖脱氢酶 (Gcd) | 催化 | 敲除gcd以避免木糖被氧化为木糖酸（死端产物），保证木糖有效利用 |
| Pseudomonas putida KT2440 | 果糖-6-磷酸代谢 | fbp | 果糖-1,6-二磷酸酶 (Fbp) | 催化 | 过表达以增加F6P通量，实验表明与单独过表达Xfpk相比无额外收益 |
关键发现
- 在甘油上，过表达Xfpk使比生长速率从0.12 h^-1提高到0.18 h^-1（增加44.3%），最大OD600从4.4提高到6.6（增加50%）
- 在木糖上，整合xylABE-xfpk的菌株比生长速率从0.02 h^-1提高到0.05 h^-1（增加167%），OD600从5.73提高到7.4（增加30.2%）。产物收率方面，甘油为碳源时，黄酮（flaviolin）收率提高38.5%，甲羟戊酸收率提高25.9%
- 木糖为碳源时，黄酮收率提高49.4%，甲羟戊酸收率提高48.7%。酶活性测定显示，B. breve Xfpk产生36.25 mM AcP/OD600，远高于B. adolescentis（1.26 mM）和B. animalis（1.19 mM）及空载体对照（0.80 mM）。
研究结论
在P. putida中引入Xfpk支路可减少丙酮酸脱羧通量，提高碳保守性，从而显著增强细胞生长、生物量积累和乙酰辅酶A衍生产品的收率。该工作为在P. putida中全面实施碳守恒途径（如NOG或GATCHYC）奠定了基础，具有重要的工业应用潜力。