Efficient production of cembratriene-ol in Escherichia coli via systematic optimization
- 作者
- Haiquan Yang, Kunjie Zhang, Wei Shen, Lei Chen, Yuanyuan Xia, Wei Zou, Yu Cao, Xianzhong Chen
- 单位
- 不详; 不详; 不详; 不详; 不详; 不详; 不详; 不详
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2023）
- DOI
- 10.1186/s12934-023-02022-4
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
烟草来源的cembratriene-ol在植物中含量低、化学合成困难，且已有重组宿主产量低，无法满足工业化生产需求
研究策略
在E. coli中异源表达Pantoea ananatis的GGPP合酶（CrtE/gppps）和Nicotiana tabacum的cembratriene-ol合酶（CBTS），系统调控关键基因（dxs、idi、ispA、ispD、ispF等）的表达水平，结合发酵优化、异源MVA途径引入及15-L发酵罐放大生产
核心内容
以大肠杆菌为宿主，通过系统代谢工程策略实现了烟草来源的cembratriene-ol的高效异源合成。研究首先在BL21(DE3)中引入来源于Pantoea ananatis的GGPP合酶（gppps）和截短型烟草cembratriene-ol合酶（cbts*，去除质体转运肽），发现初始菌株产量极低（1.58×10⁻² mg/L），而截短型合酶可使产量提升20倍。随后对DXP途径关键基因（dxs、idi、ispA、ispD、ispF等）进行系统表达调控，通过逐步共表达与拷贝数优化，菌株Z28产量达到83.91 mg/L。进一步引入链霉菌异源MVA途径并优化发酵条件（葡萄糖与酵母提取物配比4:8，72 h），产量较初始菌株提升3357.5倍。最终在15-L发酵罐中放大生产，80小时产量达371.2 mg/L，OD600最高102.3，残糖低于0.5 g/L，为当时报道的最高水平。研究表明系统性优化前体供给与合酶表达是提升萜类化合物产量的有效策略，该工程菌株具备工业化生产潜力。
创新点
系统优化多个关键酶基因的拷贝数/表达水平；首次在15-L发酵罐中实现cembratriene-ol的高产（371.2 mg/L，为当时最高报道）；引入链霉菌异源MVA途径提高产量
研究对象（13）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | DXP途径 | dxs | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 | 催化 | 来自E. coli，DXP途径限速酶，过表达提高前体供给 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | DXP途径 | idi | 异戊烯基二磷酸异构酶 | 催化 | 来自Haematococcus lacustris，调控IPP和DMAPP比例 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 萜类合成途径 | gppps (gggps) | 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶 (CrtE) | 催化 | 来自Pantoea ananatis，催化FPP生成GGPP |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 萜类合成途径 | cbts* (cbts) | cembratriene-ol合酶 | 催化 | 来自Nicotiana tabacum，截短体去除质体转运肽，产量提高20倍 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | DXP途径 | ispA | 法尼基焦磷酸合酶 | 催化 | 来自E. coli，催化IPP/DMAPP生成FPP |
| Escherichia coli BL21(DE3) | DXP途径 | ispD | 2-C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸胞苷酰转移酶 | 催化 | 来自E. coli，DXP途径中游基因 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | DXP途径 | ispF | 2-C-甲基-D-赤藓醇2,4-环二磷酸合酶 | 催化 | 来自E. coli，DXP途径中游基因 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | MVA途径（异源） | orfA | 乙酰-CoA羧化酶 | 催化 | 来自Streptomyces，密码子优化 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | MVA途径（异源） | orfB | 乙酰乙酰-CoA合酶 | 催化 | 来自Streptomyces，密码子优化 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | MVA途径（异源） | orfC | 羟甲基戊二酰-CoA合酶 | 催化 | 来自Streptomyces，密码子优化 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | MVA途径（异源） | orfD | 羟甲基戊二酰-CoA还原酶 | 催化 | 来自Streptomyces，密码子优化 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | MVA途径（异源） | hmgr | 甲羟戊酸激酶 | 催化 | 来自Streptomyces，密码子优化 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | MVA途径（异源） | orfE | 甲羟戊酸二磷酸脱羧酶 | 催化 | 来自Streptomyces，密码子优化 |
关键发现
- 初始菌株Z14产cembratriene-ol仅1.58×10^-2 mg/L
- 截短型CBTS*（去除质体转运肽）使产量提高20倍
- 共表达dxs和idi使产量达1.19 mg/L（提高3.75倍）
- 进一步调节表达使Z17产量达3.03 mg/L
- 系统调控gppps、cbts*、dxs、idi表达后Z20产量达4.63 mg/L，较Z17提高1.53倍
- 过表达ispA、ispD、ispF后Z28产量达83.91 mg/L
- 发酵优化（葡萄糖:酵母提取物=4:8，72 h）产量达53.72 mg/L，较初始Z14提高3357.5倍
- 引入MVA途径使Z27产量较Z25提高1.13倍（24 h）
- 15-L发酵罐中80 h产量达371.2 mg/L，OD600最高102.3，残糖低于0.5 g/L
研究结论
通过系统优化，E. coli中cembratriene-ol的产量得到显著提升，构建的重组菌具有工业化生产应用潜力