高级醇 · 代谢工程文献库

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Engineering of Saccharomyces cerevisiae as a platform strain for microbial production of sphingosine-1-phosphate

作者
In-Seung Jang, Sung Jin Lee, Yong-Sun Bahn, Seung-Ho Baek, Byung Jo Yu
单位
Low-Carbon Transition R&D Department, Korea Institute of Industrial Technology (KITECH), Research Institute of Sustainable Development Technology, Cheonan 31056, Republic of Korea; Department of Biotechnology, College of Life Science and Biotechnology, Yonsei University, Seoul 03722, Republic of Korea; Center for Bio-Based Chemistry, Korea Research Institute of Chemical Technology (KRICT), Ulsan 44429, Republic of Korea
杂志
Microbial Cell Factories（2024）
DOI
10.1186/s12934-024-02579-8
所属领域
代谢工程
关键词
Electrospray ionization mass spectrometryMetabolic engineeringSaccharomyces cerevisiaeSphingolipid biosynthesisSphingosine-1-phosphate
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解决的核心问题

开发高效、低成本的微生物生产鞘氨醇-1-磷酸（S1P）的方法，替代复杂且昂贵的化学合成和血液提取工艺。

研究策略

以酿酒酵母CEN.PK2-1D为底盘，通过代谢工程引入人源鞘脂合成途径：整合人源DES1、ACER1、SPHK1基因，敲除DPL1、LCB5、ORM1基因，并结合需氧高密度培养及补料分批发酵优化，构建产S1P的平台菌株。

研究路线图

100%
研究问题：开发高效低成本微生物生产S1P方法
底盘菌株：酿酒酵母CEN.PK2-1D
策略：整合人源基因DES1、ACER1、SPHK1
策略：敲除DPL1、LCB5、ORM1基因
发酵优化：需氧高密度补料分批发酵
结果：鞘氨醇最高215.8~647.5mg/L
验证：ESI-MS检测到S1P特征峰(m/z 202.17)
结果：二氢鞘氨醇最高803.4mg/L，植物鞘氨醇401.4mg/L
结论：成功构建产S1P酿酒酵母平台菌株
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核心内容

本研究以酿酒酵母CEN.PK2-1D为底盘，通过代谢工程构建了鞘氨醇-1-磷酸（S1P）的微生物生产平台菌株。研究整合表达人源DES1、ACER1和SPHK1基因构建异源鞘脂合成途径，并敲除DPL1、LCB5和ORM1以优化代谢流，随后结合需氧高密度培养和补料分批发酵进行系统优化。结果显示，DDLA菌株在需氧摇瓶补料发酵中鞘氨醇最高产量达215.8 mg/L，而10L生物反应器中该菌株鞘氨醇产量进一步提升至647.5 mg/L，二氢鞘氨醇为714.3 mg/L；在此基础上过表达SUR2和YDC1的DDLAOGs菌株使二氢鞘氨醇产量达803.4 mg/L，较DDLA提高12%。S1P通过ESI-MS在m/z 202.17处检测到特征峰，且峰高随发酵时间增加。该研究首次证明工程化酿酒酵母可作为S1P微生物生产的可行平台，为鞘脂类化合物的低成本工业化生产提供了新途径。

创新点

['首次报道利用代谢工程酿酒酵母生产S1P', '引入人源鞘脂代谢异源途径（DES1、ACER1、SPHK1）', '通过基因敲除（DPL1、LCB5、ORM1）优化代谢流', '系统优化发酵条件（需氧/厌氧、初始细胞密度、诱导型启动子）', '利用ESI-MS定性验证S1P生产']

研究对象（8）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1D 鞘脂生物合成途径 DES1 Des1 (sphingolipid delta 4 desaturase) 催化 人源基因，催化二氢鞘氨醇/二氢神经酰胺生成鞘氨醇/神经酰胺，整合于DPL1位点，由TDH3启动子驱动
Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1D 鞘脂生物合成途径 ACER1 Acer1 (alkaline ceramidase 1) 催化 人源基因，催化神经酰胺水解生成鞘氨醇，整合于LCB5位点，由TDH3启动子驱动
Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1D 鞘脂生物合成途径 SPHK1 Sphk1 (sphingosine kinase 1) 催化 人源基因，催化鞘氨醇磷酸化生成S1P，受GAL1或SUC2诱导型启动子控制，整合于ORM1位点
Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1D 鞘脂生物合成途径 DPL1 Dpl1 (dihydrosphingosine phosphate lyase) 催化 内源基因被敲除，防止S1P降解为脂肪酸醛和磷酸乙醇胺，促进鞘氨醇前体积累
Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1D 鞘脂生物合成途径 LCB5 Lcb5 (sphingoid long-chain base kinase) 催化 内源基因被敲除，阻止二氢鞘氨醇/植物鞘氨醇磷酸化形成副产物，提高鞘氨醇产量
Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1D 鞘脂生物合成途径 ORM1 Orm1 (negative regulator of serine palmitoyltransferase) 调控 内源基因被敲除，解除对丝氨酸棕榈酰转移酶的负调控，增强鞘脂合成通量
Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1D 鞘脂生物合成途径 SUR2 Sur2 (sphinganine C4-hydroxylase) 催化 讨论中提及的未来策略，敲除可减少植物鞘氨醇生成，提高鞘氨醇水平
Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1D 鞘脂生物合成途径 YDC1 Ydc1 (dihydroceramidase) 催化 讨论中提及的未来策略，敲除可减少二氢神经酰胺降解为二氢鞘氨醇，可能提高S1P产量

关键发现

  1. DDLA菌株在需氧高细胞密度摇瓶补料分批发酵中鞘氨醇最高产量为215.8 mg/L（60 h），厌氧高密度仅42.7 mg/L
  2. DDLAOGs菌株摇瓶发酵中二氢鞘氨醇最高达402.7 mg/L（比DDLA提高1.7倍），鞘氨醇在36 h积累至167.1 mg/L
  3. 10L生物反应器中，DDLA菌株鞘氨醇最高647.5 mg/L，二氢鞘氨醇714.3 mg/L，植物鞘氨醇401.4 mg/L
  4. DDLAOGs菌株鞘氨醇431.3 mg/L，二氢鞘氨醇803.4 mg/L（较DDLA增加12%），植物鞘氨醇207.7 mg/L（较DDLA减少48%）
  5. S1P通过ESI-MS在m/z 202.17处检测到特征峰，且峰高随发酵时间增加。

研究结论

成功构建了产S1P的酿酒酵母平台菌株，通过引入人源DES1、ACER1和SPHK1基因并敲除DPL1、LCB5、ORM1，结合需氧高密度补料分批发酵，实现了鞘脂类物质（包括S1P）的微生物生产。这是首个证明工程化酿酒酵母可作为S1P微生物生产平台菌株的研究。