Identification of squalene epoxidase in triterpenes biosynthesis in Poria cocos by molecular docking and CRISPR-Cas9 gene editing
- 作者
- Xiao-liu Liu, Jing Xie, Zhen-ni Xie, Can Zhong, Hao Liu, Shui-han Zhang, Jian Jin
- 单位
- Institute of Chinese Medicine Resources, Hunan Academy of Chinese Medicine, Changsha 410013, China; Hunan Academy of Chinese Medicine, Hunan University of Traditional Chinese Medicine, Changsha 410208, China
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2024）
- DOI
- 10.1186/s12934-024-02306-3
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
鉴定茯苓三萜生物合成途径中鲨烯环氧酶（PcSE）的基因功能并建立CRISPR/Cas9基因编辑系统，以阐明PcSE在三萜合成中的关键作用。
研究策略
克隆PcSE基因，利用AlphaFold建模和分子对接预测蛋白活性位点；基于活性位点设计sgRNA，构建双sgRNA CRISPR/Cas9敲除载体；通过PEG介导的原生质体转化实现基因编辑，并用UHPLC-QTOF-MS/MS分析三萜含量变化。
核心内容
该研究在茯苓中克隆了鲨烯环氧酶基因PcSE，其开放阅读框长1413 bp，编码470个氨基酸。通过AlphaFold建模与分子对接预测蛋白活性位点，结合能为-7.4 kcal/mol，关键残基包括VAL13、ALA14、ARG38、ASP162等。基于活性位点设计双sgRNA，利用PEG介导的原生质体转化建立CRISPR/Cas9基因编辑系统，成功获得5个突变株。UHPLC-QTOF-MS/MS检测显示，在9种三萜成分中有6种在突变株中完全未检出，仅DTUA、DPA和PA存在痕量残留且相对含量极显著低于野生型，证实PcSE缺失严重抑制三萜合成。研究首次在茯苓中建立了CRISPR/Cas9编辑体系，并结合分子对接定向靶向功能位点，从体内水平验证了PcSE催化鲨烯生成2,3-环氧鲨烯的关键限速酶功能，为茯苓三萜的异源生物合成及代谢工程改造提供了重要工具和理论依据。
创新点
首次在茯苓中建立CRISPR/Cas9基因编辑系统；将分子对接与sgRNA设计相结合，靶向功能活性位点；通过基因敲除首次验证PcSE的体内功能。
研究对象（1）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Poria cocos (茯苓) | 三萜生物合成途径 | PcSE | 鲨烯环氧酶 (squalene epoxidase) | 催化 | 催化鲨烯生成2,3-环氧鲨烯，是三萜和甾醇合成的限速酶 |
关键发现
- PcSE基因组序列长1570 bp，ORF为1413 bp，编码470个氨基酸
- 分子对接结合能为-7.4 kcal/mol，预测活性位点为VAL13、ALA14、ARG38、VAL47、ASP162、PRO270和ALA309
- 蛋白模型评估显示100%残基位于合理区域（94.7%最优区、5.3%可接受区），ERRAT评分为96.214
- CRISPR/Cas9敲除获得5个突变株（Mu1-Mu5），突变类型包括1 bp缺失、2 bp缺失、1 bp插入+2 bp缺失、1 bp替换+2 bp缺失、4 bp缺失+1 bp替换+3 bp插入
- UHPLC-QTOF-MS/MS检测9种三萜成分，其中6种在突变株中未检出，仅DTUA、DPA和PA有痕量残留，且相对含量极显著低于野生型，证明PcSE缺失抑制三萜合成。
研究结论
成功克隆并编辑了茯苓PcSE基因，证实PcSE具有鲨烯环氧酶功能，催化鲨烯生成2,3-环氧鲨烯，是三萜合成途径的关键限速酶；建立的CRISPR/Cas9系统为茯苓次生代谢产物异源生物合成研究奠定了基础。